李小波,王斌梁,王星鈞

(浙江省臺州市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 318020)

過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制為多種內(nèi)外界因子的共同刺激下，而引發(fā)肥大細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞及中性粒細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而導(dǎo)致氣道上皮發(fā)生炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、黏液分泌及氣道高反應(yīng)性[1-2]。過敏性哮喘于中國特別是兒童有較大基數(shù)的患病人口，過敏性哮喘由于過敏原的難發(fā)現(xiàn)及難避免，以及極易因超敏反應(yīng)的發(fā)生而誘發(fā)阻塞性肺氣腫、呼吸衰竭與驟停、心律失常、氣胸和縱隔氣腫等嚴(yán)重的并發(fā)癥[3-4]。因此，過敏性哮喘已成為危害人們特別是兒童生命健康的重要疾病。但目前對過敏性哮喘的作用機(jī)制主要停留在，由于吸入特異性或非特異性過敏原而引發(fā)的一系列細(xì)胞因子應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制及環(huán)境與遺傳易感性上[5-6]。對因氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性改變而引發(fā)的一系列氣道炎癥、增殖、高反應(yīng)及過度分泌研究較少。因此本研究試圖通過對過敏性哮喘小鼠模型緊密連接蛋白-18(Claudin-18)、白細(xì)胞介素(IL)-13、IgE、氣道高反應(yīng)檢測(AHR)的分析，探究IL-13通過下調(diào)Claudin-18蛋白水平對過敏性哮喘相關(guān)性及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

健康10周齡SPF級C57BL/6小鼠購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；卵清蛋白(OVA)購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；IL-13 ELISA試劑盒、IL-13抑制劑均購自上海西唐生物科技有限公司；IgE ELISA試劑盒購自英國Abcam公司；RIzoL試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒均購自美國Invitroger公司。

1.2 方法

1.2.1哮喘建模與分組

將小鼠采用數(shù)表法隨機(jī)分為對照組、IL-13抑制組、模型組，每組12只。哮喘模型的建立采用OVA,模型組與IL-13抑制組與第1、14天將OVA(20 μg)與氫氧化鋁(2 mg)加入150 μL生理鹽水混勻后注射小鼠使其至敏。于第1、14天對IL-13組注射20 U IL-13抑制劑100 μL，對照組注射等量生理鹽水，第21天后對小鼠進(jìn)行相關(guān)實驗指標(biāo)的測定。整個實驗過程中無實驗動物死亡和標(biāo)本脫落。

1.2.2AHR水平的測定

采用呼吸曲線Penh值評估哮喘模型小鼠的氣道應(yīng)性，用整體容積描記箱(體描箱)無創(chuàng)性記錄呼吸曲線，推算Penh值并觀察乙酰甲膽堿(Mch)刺激后的變化。

1.2.3Claudin-18水平的測定

采用實時熒光定量聚合鏈反應(yīng)(RT-qPCR)對Claudin-18蛋白水平進(jìn)行檢測，首先采用Trizol提取小鼠肺組織總RNA并用50 μL無RNA酶水溶解，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA稀釋后，采用RT-qPCR試劑盒擴(kuò)增后得到擴(kuò)增產(chǎn)物采用2-ΔΔCt進(jìn)行測定。

1.2.4IL-13與IgE水平的測定

采用ELISA雙抗夾心法對小鼠肺組織勻漿進(jìn)行測定，首先經(jīng)過特異性抗原(抗體)與固相載體結(jié)合后，形成固相抗原(抗體)，并與標(biāo)本中特異性抗體(抗原)形成免疫復(fù)合物，在進(jìn)行洗板、顯色、終止等步驟后，嚴(yán)格遵循操作說明書執(zhí)行并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組AHR的比較

模型組AHR顯著高于對照組與IL-13抑制組(P=0.000,F=7.013)。見圖1。

圖1 3組AHR水平比較

2.2 3組IgE水平比較

模型組IgE水平顯著高于對照組與IL-13抑制組(P=0.000，F(xiàn)=9.224)。見圖2。

2.3 3組Claudin-18蛋白水平的比較

對照組Claudin-18蛋白水平顯著高于模型組(P=0.014，t=6.953)。IL-13抑制組Claudin-18水平顯著高于模型組(P=0.032，t=5.429)。見圖3。

圖2 3組IgE水平的比較

2.4 3組IL-13水平比較

模型組IL-13水平顯著高于對照組與IL-13抑制組(P=0.000，F(xiàn)=7.524)。見圖4。

圖3 3組Claudin-18水平的比較

圖4 3組IL-13水平的比較

2.5 AHR、IgE、IL-13、Claudin-18相關(guān)性分析

通過對 AHR、IgE、IL-13、Claudin-18相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Claudin-18 與IL-13、IgE、AHR呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；進(jìn)一步將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后以Claudin-18為因變量、IL-13為自變量建立線性回歸分析可得Y=-0.003X+4.021。見表1。

表1 AHR、IgE、IL-13、Claudin-18相關(guān)性分析

3 討 論

Claudin-18相對分子質(zhì)量約22×103，為Claudins家族成員之一，Claudin-18作為極化上皮細(xì)胞不同內(nèi)環(huán)境之間一個主要由滲透壓支配的生物屏障成分之一，并能夠通過細(xì)胞表層傳遞生物信息[6-7]。其通過控制肺氣道上電解質(zhì)及生物分子的跨膜運(yùn)輸，而對膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著至關(guān)重要的作用[8-9]。動物實驗證實，敲除Claudin-18基因后的小鼠表現(xiàn)出氣道上皮高反應(yīng)、易損傷及炎性浸潤的情況顯著增高[10-11]。IL-13為相對分子質(zhì)量約12×103并由132個氨基酸組成的非糖基化多功能蛋白，主要來自TH2細(xì)胞的分泌。其主要功能為誘導(dǎo)B細(xì)胞活化產(chǎn)生漿細(xì)胞并釋放免疫活性物質(zhì)，并參與過敏性免疫球蛋白IgE的轉(zhuǎn)化[12-13]。IL-13在介導(dǎo)過敏性哮喘的過程主要體現(xiàn)在其參與炎癥作用機(jī)制與通過間接途徑調(diào)控氣道上皮細(xì)胞的穩(wěn)定性，以及刺激氣道黏膜細(xì)胞的增殖與黏液分泌上。臨床研究顯示，IL-13不僅參與過敏性哮喘嗜酸性粒細(xì)胞的脫顆粒過程，還能通過下調(diào)Claudin-18相對表達(dá)水平而調(diào)控上皮細(xì)胞的物質(zhì)交換與破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境間的生物屏障，并最終破壞氣道上皮細(xì)胞的穩(wěn)定性，而大量研究證實氣道上皮黏膜的穩(wěn)定性與完整性與過敏性哮喘的高氣道反應(yīng)及嚴(yán)重反應(yīng)存在著顯著的相關(guān)性。因此，在過敏性哮喘的機(jī)制中IL-13一方面能通過由DRMDL3基因介導(dǎo)下上下游信號通路過度活化，致使炎癥等相關(guān)的趨化因子的聚集，而引發(fā)氣道平滑肌的收縮、增殖及黏液過度分泌；另一方面能通過作用于Claudin-18而導(dǎo)致氣道穩(wěn)定性的破壞，而引發(fā)氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。

本研究通過對3組AHR的分析，結(jié)果顯示模型組AHR顯著高于對照組與IL-13抑制組(P<0.05),說明IL-13與氣道高反應(yīng)性存在顯著的相關(guān)性，并且通過IL-13抑制劑能有效地降低小鼠氣道高反應(yīng)性。通過對3組IgE水平的分析，結(jié)果顯示模型組的IgE水平顯著高于對照組與IL-13抑制組(P<0.05)，這表明過敏性哮喘模型的建立較成功，且表明通過抑制IL-13的水平能有效降低IgE的表達(dá)水平，這可能與IL-13能有效地促進(jìn)肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的脫顆粒并刺激小鼠漿細(xì)胞產(chǎn)生IgE免疫球蛋白有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組與抑制組的Claudin-18蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05)，這表明IL-13可能與Claudin-18蛋白水平存在一定的相關(guān)性，且通過抑制IL-13能顯著提高Claudin-18蛋白水平。通過對3組IL-13水平的比較，模型組的IL-13水平顯著高于對照組與IL-13抑制組(P<0.05)。這與IL-13抑制劑的作用，與過敏性哮喘模型的炎癥機(jī)制激發(fā)IL-13的聚集與分泌有關(guān)系。與王桂蘭等[14]研究結(jié)果相符合。本研究通過對 AHR、IgE、IL-13、Claudin-18進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Claudin-18與IL-13、IgE、AHR呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；進(jìn)一步將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后以Claudin-18為因變量、IL-13為自變量建立線性回歸分析可得Y=-0.003X+4.021。表明Claudin-18與IL-13存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，IL-13與Claudin-18存在顯著的負(fù)相關(guān)線性關(guān)系，并能夠通過下調(diào)Claudin-18水平導(dǎo)致氣道上皮完整性與穩(wěn)定性的破壞，進(jìn)而促進(jìn)過敏性哮喘的氣道高反應(yīng)性。