王 麗，劉佳育

(1.天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院呼吸內(nèi)科 300270；2.天津市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科 300000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球第三大死因[1]。合并其他疾病，特別是伴有或不伴有肌肉丟失的骨骼肌功能障礙，是COPD患者的特征，甚至在疾病的早期階段也是如此[2]。在COPD患者中，股骨骼肌無(wú)力(定義為肌力下降)和質(zhì)量損失已經(jīng)被證明可以預(yù)測(cè)患者的生存率和死亡率[3]。然而，COPD肌肉功能障礙的病因尚不清楚，研究表明，先前的發(fā)生可能與線粒體紊亂、氧化應(yīng)激、全身炎癥和肌肉萎縮有關(guān)[4-5]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)是一小類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的成員，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子控制與線粒體代謝、生物發(fā)生和氧化應(yīng)激有關(guān)的基因表達(dá)[6]。作為PGC-1α的下游靶基因，沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白3(SIRT3)主要位于線粒體基質(zhì)中，其通過(guò)可逆酶脫乙酰化作用調(diào)節(jié)線粒體脂肪酸氧化[7]。SIRT3還與線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈的酶復(fù)合物相互作用，增加復(fù)合物活性，從而有助于電子傳遞[7]。吸煙是COPD最常見(jiàn)的病因之一，據(jù)報(bào)道，在8周內(nèi)每天暴露于香煙煙霧中小鼠的比目魚(yú)肌和趾長(zhǎng)肌中觀察到PGC-1α和SIRT3 mRNA的表達(dá)顯著降低[8]。

槲皮素是植物中含量最豐富的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌等多種生物活性[9]。已證明槲皮素的抗氧化活性與清除活性氧的能力有關(guān)，并通過(guò)多種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧攻擊[10]。線粒體是活性氧的一個(gè)重要來(lái)源，有報(bào)道稱為槲皮素的另一個(gè)治療靶點(diǎn)[11]。槲皮素對(duì)線粒體的影響在糖尿病、癌癥、衰老和神經(jīng)退行性等疾病中得到廣泛研究[12-13]。然而，口服槲皮素能否改善COPD進(jìn)展過(guò)程中骨骼肌線粒體功能損傷尚不清楚。因此，本研究旨在探討槲皮素對(duì)氣管內(nèi)注射脂多糖并結(jié)合香煙煙霧暴露所致COPD大鼠模型中骨骼肌線粒體及PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和處理方法

本研究共使用48只雄性Wistar大鼠(年齡8周)，體重180～220 g。所有大鼠均購(gòu)自上海SIPPR/BK實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(合格證編號(hào)：SCXK 2008-0016)，并在光照12 h/黑暗12 h，濕度70%、溫度(20±2)℃的無(wú)病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。為了進(jìn)行生化分析，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=16)、COPD組(n=16)和槲皮素組(n=16)。COPD組和槲皮素組大鼠分別于第1天和第15天氣管內(nèi)滴注脂多糖(1 mg/mL，0.2 mL，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，并在除第1天和第15天外的60 d里每天暴露于6支未經(jīng)過(guò)濾的商業(yè)香煙(購(gòu)自湖南中研實(shí)業(yè)有限公司；每支香煙含有1.4 mg尼古丁和14 mg焦油碳)煙霧中30 min，每日2次，煙霧暴露箱為70 cm×60 cm×50 cm。對(duì)照組大鼠接受類似的治療，但采用氣管內(nèi)滴注生理鹽水和暴露于空氣中的方法。從第31天開(kāi)始，所有大鼠每天灌胃1次。對(duì)照組和COPD組大鼠灌服生理鹽水，槲皮素組COPD大鼠灌服槲皮素(100 mg/kg)。本研究中使用的槲皮素劑量基于先前的實(shí)驗(yàn)[14]和筆者的初步研究。

1.2 肺功能檢查

在第62天，對(duì)大鼠進(jìn)行稱重和麻醉。在第二和第三軟骨環(huán)處用倒Y形切口打開(kāi)氣管，并立即用Y型套管插管，然后測(cè)量肺的吸氣量和呼氣量。氣管內(nèi)Y型插管的出口連接到與PLY3211小型動(dòng)物肺功能測(cè)定儀(美國(guó)Buxco-Research-Systems公司)相連的壓力傳感器，另一側(cè)用于向肺內(nèi)注入空氣。氣管內(nèi)通入空氣6.0 mL，測(cè)定第0.3 秒用力呼氣量(FEV0.3)、用力肺活量(FVC)、峰值呼氣流量(PEF)和FEV0.3/FVC比值。

1.3 組織病理學(xué)評(píng)價(jià)

對(duì)大鼠進(jìn)行肺功能評(píng)價(jià)后，從心臟針刺放血。在大鼠停止呼吸后，收集右肺上葉及右比目魚(yú)肌標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定24 h，在75%乙醇中脫水12 h，包埋在石蠟中，切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色，并固定在載玻片上。此外，骨骼肌切片也用Masson三色染色。組織學(xué)評(píng)價(jià)由一位病理學(xué)專家通過(guò)CX31顯微鏡(日本Olympus公司)進(jìn)行觀察和拍攝切片，計(jì)算骨骼肌膠原體積分?jǐn)?shù)，即膠原總面積除以整個(gè)視野面積。

1.4 骨骼肌線粒體功能評(píng)價(jià)

1.4.1線粒體分離

使用線粒體粗提分離試劑盒(上海Genemed scientifics公司)從比目魚(yú)肌中分離出骨骼肌線粒體。按照說(shuō)明書(shū)操作，在4 ℃下，通過(guò)1 000×g離心10 min除去細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞。然后將上清液在4 ℃下，用10 000×g離心10 min，獲得線粒體部分，并將其懸浮在線粒體存儲(chǔ)液中，置于-80 ℃下保存。

1.4.2線粒體酶活性測(cè)定

根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)(南京建成生物工程研究所)，用相應(yīng)試劑盒測(cè)定骨骼肌線粒體中細(xì)胞色素C氧化酶(COX)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。

1.4.3線粒體氧化參數(shù)測(cè)定

根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)(南京建成生物工程研究所)，用相應(yīng)試劑盒測(cè)定骨骼肌線粒體中的氧化參數(shù)，包括用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(MDA)水平，用分光光度法測(cè)定錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和過(guò)氧化氫酶的活性。

1.5 細(xì)胞因子測(cè)定

將左比目魚(yú)肌冷凍組織標(biāo)本置于含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的冷RIPA裂解緩沖液中勻漿。勻漿在4 ℃下以14 000×g離心20 min，使用相應(yīng)的ELISA試劑盒(上海麥濟(jì)生物技術(shù)有限公司)測(cè)定上清液中白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

1.6 實(shí)時(shí)PCR分析

使用TRIZOL試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從左比目魚(yú)肌中提取總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)和7500序列檢測(cè)實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。通過(guò)GAPDH校正并使用公式x=2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。所用PCR引物的核苷酸序列如下：SIRT3正向：5′-TACAGAAATCAGTGCCCCGA-3′，反向：5′-GGTGGACACAAGAACTGCTG-3′；PGC-1α正向：5′-ATGAGAAG CGGGAGTCTGAA-3′，反向：5′-GCGGTCTCTCAGTTCTGTCC-3′；GAPDH正向：5′-TGCCACTCAGAAGA CTGTGG-3′，反向：5′-TTCAGCTCTGG GATGACCTT-3′。

1.7 Western blot分析

在冰冷的RIPA裂解緩沖液中裂解左比目魚(yú)肌組織，然后在4 ℃下勻漿。將細(xì)胞裂解物在4 ℃下12 000×g離心30 min以除去細(xì)胞碎片。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在8%～10%SDS-PAGE凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)(50 μg)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后與針對(duì)PGC-1α(1∶1 000，英國(guó)Abcam公司)、SIRT3(1∶500，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)和GAPDH(1∶1 000，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)的特異性抗體一起孵育過(guò)夜。在室溫下用適當(dāng)?shù)睦备^(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1:5 000；美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)覆蓋2 h。最后，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Pierce Biotechnology公司)觀察印跡。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 COPD大鼠模型評(píng)價(jià)及槲皮素對(duì)其影響

為確定COPD大鼠模型的建立是否成功，對(duì)其體重、肺功能和肺組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行了測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)期間，COPD組和槲皮素組各有1只大鼠死亡，死亡大鼠肺中可見(jiàn)大量肺大泡。呼吸衰竭和(或)灌胃刺激可能導(dǎo)致這些大鼠死亡。與對(duì)照組比較，COPD組和槲皮素組大鼠的體重增長(zhǎng)速度明顯減慢(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。在肺功能參數(shù)測(cè)定中，COPD組和槲皮素組大鼠PEF和FEV0.3/FVC均較對(duì)照組明顯降低[(4.90±0.82)mL/svs. (3.19±0.48)mL/s、(4.10±0.61)mL/s，P<0.05；(96.41±4.37)%vs. (63.50±11.50)%、(80.38±8.20)%，P<0.05)]，見(jiàn)圖1B、C。組織學(xué)分析顯示，從對(duì)照組大鼠獲得的肺組織樣本顯示肺泡間隔薄，肺泡正常，沒(méi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)；而從COPD大鼠獲得的肺組織樣本顯示肺泡間隔受損，肺泡增大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1E)；所有這些異常經(jīng)槲皮素治療顯著減弱(圖1F)。

2.2 骨骼肌組織病理學(xué)改變及定量分析

如圖2A所示，對(duì)照組大鼠骨骼肌未見(jiàn)明顯損傷。COPD組大鼠骨骼肌出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，如肌纖維間隔增加、肌纖維萎縮和肌原纖維紊亂。此外，在COPD組大鼠中有更多的膠原沉積，而在對(duì)照大鼠中觀察到很少的纖維化。所有這些異常經(jīng)槲皮素治療顯著減弱。進(jìn)一步定量分析顯示，與對(duì)照組比較，COPD組和槲皮素組的膠原體積分?jǐn)?shù)明顯增加[(1.21±0.24)%vs.(8.50±1.12)%、(4.62±0.85)%，P<0.05]，槲皮素組的膠原體積分?jǐn)?shù)較COPD組顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖2B。

A:對(duì)照組、COPD組和槲皮素組大鼠的體重變化;B：大鼠肺功能指標(biāo)PEF；C：大鼠肺功能指標(biāo)FEV0.3/FVC；D:對(duì)照組大鼠肺組織HE染色(×200，比例尺=50 μm)；E ：COPD組大鼠肺組織HE染色(×200，比例尺=50 μm)；F：槲皮素組大鼠肺組織HE染色(×200，比例尺=50 μm)。*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，與COPD組比較。

A：對(duì)照組、COPD組和槲皮素組大鼠骨骼肌的HE和Masson三色染色(×100，比例尺=100 μm)；B：對(duì)照組、COPD組和槲皮素組大鼠骨骼肌膠原體積分?jǐn)?shù)的定量分析。*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#:P<0.05,與COPD組比較。

2.3 骨骼肌線粒體酶活性研究

COPD組和槲皮素組大鼠骨骼肌線粒體COX、SDH、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與COPD組比較，槲皮素組COPD大鼠骨骼肌線粒體COX、SDH、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠骨骼肌線粒體酶活性

2.4 骨骼肌線粒體氧化應(yīng)激研究

骨骼肌線粒體中的氧化參數(shù)如表2所示。COPD組骨骼肌線粒體MDA含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而MnSOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與COPD組比較，槲皮素組COPD大鼠骨骼肌線粒體MDA含量顯著降低(P<0.05)，MnSOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶活性顯著升高(P<0.05)。

2.5 3組骨骼肌IL-6和TNF-α水平比較

COPD組大鼠骨骼肌IL-6、TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。槲皮素顯著降低COPD大鼠骨骼肌IL-6和TNF-α水平(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 槲皮素對(duì)COPD大鼠骨骼肌線粒體氧化應(yīng)激的影響

2.6 骨骼肌PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路的變化

Western blot和實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)骨骼肌PGC-1α和SIRT3的蛋白和mRNA表達(dá)結(jié)果如圖3所示。COPD組PGC-1α和SIRT3的蛋白和mRNA水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。此外，槲皮素組PGC-1α和SIRT3的蛋白和mRNA表達(dá)較COPD組顯著升高(P<0.05)。

表3 3組骨骼肌IL-6、TNF-α水平比較

A:3組大鼠骨骼肌組織PGC-1α/SIRT3蛋白表達(dá)的Western blot圖；B：3組大鼠骨骼肌組織PGC-1α/SIRT3蛋白表達(dá)水平；C：3組大鼠骨骼肌組織PGC-1α/SIRT3 mRNA表達(dá)。*：P<0.05，與對(duì)照組比較;#：P<0.05，與COPD組比較。

3 討 論

COPD被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其患病率和病死率不斷上升[1]。調(diào)查顯示，在COPD進(jìn)展期間，30%～40%的患者出現(xiàn)骨骼肌質(zhì)量損失和功能障礙[15]。并且由于骨骼肌萎縮，COPD患者可能出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良，并與病情惡化和病死率有關(guān)[16]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，隨著COPD嚴(yán)重程度的增加，股四頭肌無(wú)力變得更加嚴(yán)重[17]。此外，在身體活動(dòng)相對(duì)正常，氣流受輕至中度阻塞的COPD患者中也觀察到明顯的肌肉無(wú)力，甚至在沒(méi)有COPD的吸煙者中也觀察到此現(xiàn)象，提示骨骼肌功能障礙可能在呼吸癥狀發(fā)作之前的早期發(fā)生[18]。線粒體功能損傷是COPD患者骨骼肌功能障礙的最重要機(jī)制之一[19]。因此，保護(hù)骨骼肌線粒體功能損傷對(duì)于改善COPD進(jìn)展中骨骼肌功能障礙至關(guān)重要。本研究根據(jù)體重、肺功能和肺組織形態(tài)學(xué)三個(gè)參數(shù)建立COPD大鼠模型。與對(duì)照組比較，COPD大鼠體重增加速度明顯減慢，PEF和FEV0.3/FVC明顯降低，并且大鼠肺泡間隔破壞，肺泡增大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以及骨骼肌線粒體功能受到明顯破壞。這些結(jié)果表明，COPD大鼠模型的建立是成功的。本研究進(jìn)一步調(diào)查了槲皮素對(duì)COPD大鼠的治療作用，結(jié)果顯示，槲皮素減輕COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷與PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)。

槲皮素具有多種藥理活性，其可以通過(guò)減輕線粒體功能損傷對(duì)多種疾病發(fā)揮治療作用[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以減輕以氣道炎癥和肺氣腫為特征的COPD大鼠肺泡上皮細(xì)胞線粒體損傷[20]。因此，本研究對(duì)槲皮素是否也能減輕COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷作了進(jìn)一步探討。病理學(xué)研究表明，COPD大鼠骨骼肌發(fā)生肌纖維間隔增加、肌纖維萎縮和肌原纖維紊亂，經(jīng)槲皮素治療可明顯改善這些病理特征，表明槲皮素對(duì)COPD進(jìn)展過(guò)程中的骨骼肌功能障礙具有治療作用。與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]。本研究結(jié)果表明，COPD大鼠骨骼肌線粒體功能受到了明顯破壞，口服槲皮素可提高COPD大鼠骨骼肌線粒體酶活性。有報(bào)道稱線粒體是氧化應(yīng)激的中心，線粒體功能損傷可顯著誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[21]。最近的證據(jù)表明，槲皮素的抗炎和抗氧化作用尤為重要[10]。槲皮素可以抑制脂多糖刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞或肺泡巨噬細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[22-23]。槲皮素不僅可以通過(guò)清除活性氧和氮來(lái)誘導(dǎo)抗氧化活性，還可以通過(guò)激活抗氧化酶的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)抗氧化活性[10]。因此，本研究進(jìn)一步分析了槲皮素對(duì)COPD大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響，通過(guò)測(cè)定COPD大鼠骨骼肌線粒體中MDA、MnSOD、GSH-Px和過(guò)氧化氫酶含量，發(fā)現(xiàn)槲皮素能顯著降低氧化應(yīng)激水平，增加抗氧化能力。此外，COPD大鼠骨骼肌促炎癥細(xì)胞因子(IL-6和TNF-α)顯著升高，槲皮素可逆轉(zhuǎn)這些升高。因此，槲皮素對(duì)COPD大鼠骨骼肌線粒體具有保護(hù)作用。

PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路為調(diào)節(jié)線粒體代謝、生物發(fā)生和氧化應(yīng)激的必需因子[24]。PGC-1α通過(guò)協(xié)同激活多種核轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)線粒體功能，從而增加包括SIRT3在內(nèi)的核編碼線粒體蛋白的表達(dá)[25]。SIRT3作為sirtuin家族成員，主要定位于線粒體，并通過(guò)靶向中樞代謝中的幾種酶調(diào)節(jié)幾個(gè)關(guān)鍵的氧化途徑[26]。以往的研究已經(jīng)證明，PGC-1α基因敲除可以有效降低肌肉細(xì)胞和肝細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)，SIRT3通過(guò)幾種代謝和呼吸酶的去乙?；瘉?lái)調(diào)節(jié)重要的線粒體功能[27]。然而，PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路對(duì)COPD骨骼肌線粒體的影響尚不清楚。本研究表明，COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷時(shí)，PGC-1α和SIRT3的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能上調(diào)COPD大鼠骨骼肌PGC-1α和SIRT3的表達(dá)，提示PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路參與了槲皮素對(duì)COPD大鼠骨骼肌線粒體的保護(hù)作用和骨骼肌功能障礙的進(jìn)展。然而，PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路在COPD骨骼肌功能障礙中的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究在COPD模型大鼠中發(fā)現(xiàn)了以肌纖維間隔增加、肌纖維萎縮和肌原纖維紊亂為特征的骨骼肌損傷。槲皮素可通過(guò)減輕COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷來(lái)改善骨骼肌形態(tài)學(xué)，部分原因可能與PGC-1α/SIRT3信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明口服槲皮素治療COPD骨骼肌功能障礙是可行的。