趙 莉,孫中磊,楊 齊,劉英富,張 賽,3

(1.中國人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心,天津,300162;2.山東省棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院,山東 棗莊,277000; 3.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300162; 4.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校納米抗體研究所,河北 滄州,061001)

創(chuàng)傷后認(rèn)知功能障礙是一種進(jìn)行性和致命性的神經(jīng)退行性疾病，因其漸進(jìn)性的記憶喪失、認(rèn)知困難和思想意識損害，嚴(yán)重影響患者日?；顒?dòng)[1-2]。神經(jīng)病理學(xué)的特征包括細(xì)胞內(nèi)高磷酸化的tau聚集和細(xì)胞外β-淀粉樣斑塊形成，與阿爾茨海默病(AD)先天免疫的激活、突觸功能障礙和神經(jīng)元丟失相一致[3]。髓樣細(xì)胞2(TREM2)是一種免疫球蛋白(Ig)超家族受體，其表達(dá)增加對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)具有保護(hù)作用，主要表現(xiàn)為對小膠質(zhì)細(xì)胞高度特異性，且已經(jīng)在各種鼠模型中進(jìn)行了研究[4]。神經(jīng)元自噬已被證實(shí)在神經(jīng)退行性疾病中有助于清除錯(cuò)誤折疊的蛋白和減少炎癥細(xì)胞因子[5]。目前，關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞自噬作用機(jī)制的研究仍較少。研究[6]表明，小膠質(zhì)細(xì)胞自噬有助于β淀粉樣蛋白(Aβ)的清除，抑制炎性小體3(NLRP3)的激活，改善認(rèn)知功能障礙。已有研究[7]表明TREM2影響小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞表型和激活狀態(tài)，但TREM2相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬對大鼠顱腦創(chuàng)傷(TBI)后認(rèn)知功能作用機(jī)制尚未闡明。本研究通過建立過表達(dá)TREM2大鼠TBI模型，探討TREM2相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬作用，以期為TBI后認(rèn)知功能障礙尋找新的治療方向，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性SD大鼠24只,28～32月齡，體質(zhì)量600～700 g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按照醫(yī)院批準(zhǔn)的動(dòng)物規(guī)程和指南進(jìn)行?？贵w Aβ1-42、tau、TREM2、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、β-actin(美國Abcam公司)，AAVrh.10 TREM2和AAVrh.10Null(濟(jì)南思科生物科技有限公司)。SYBR Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TBI模型與分組:大鼠TBI模型采用皮質(zhì)撞擊致傷法建立[8],術(shù)前8 h禁食禁飲,2%異氟烷吸入麻醉后備皮，沿矢狀縫切開皮膚，剝離骨膜，在前囟右后外側(cè)3 mm處行顱鉆鉆孔(直徑約4 mm),顯露硬腦膜，俯臥位固定于立體定向儀上，將eCCI打擊臂調(diào)整至與垂直方向呈20°角，使用3 mm打擊帽精確打擊大腦皮層。打擊參數(shù)為(AP為-2.5 mm,R為2.5 mm,H為3 mm),打擊速率均為5 m/s,打擊最低點(diǎn)持續(xù)時(shí)間均為200 ms。試驗(yàn)過程中，大鼠均未出現(xiàn)需安樂死的嚴(yán)重并發(fā)癥。

將24只大鼠隨機(jī)分為sham組(假手術(shù))、TBI組和TBI并TREM2組(TREM2過表達(dá))，每組8只。其中TBI組和TBI并TERM2組采用皮質(zhì)打擊構(gòu)建大鼠TBI模型,sham組僅開骨窗;TREM2過表達(dá)模型采用腺病毒相關(guān)病毒(AAVrh.10)AAVrh.10 TREM2腦室注射構(gòu)建,sham組和TBI組注射等量AAVrh.10衣殼AAVrh.10Null。實(shí)驗(yàn)28 d,采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評估各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，取腦組織，采用免疫印跡法(Western blot)評估TREM2和認(rèn)知相關(guān)蛋白表達(dá)水平，Western blot法和免疫熒光評估自噬蛋白表達(dá)水平。

1.2.2 慢病毒載體治療:將小鼠麻醉并固定在立體定位框架上，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，將慢病毒載體注射到右側(cè)腦室(立體定位坐標(biāo):向外1.7 mm,向后1.2 mm,硬腦膜下方3.0 mm,中線附近1.0 mm,前囟后0.2 mm,顱骨以下3.0 mm),將33號針頭的Hamilton 710系列注射器(1～5 μL)固定在立體定向儀的注射泵上，針頭緩慢進(jìn)入目標(biāo)結(jié)構(gòu)，停留1 min,向雙側(cè)腦室分別注射載體(每個(gè)部位2 μL，速度0.5 μL/min),注射后，針頭停留2 min以減少回流，然后緩慢撤回。注射后，縫合皮膚，觀察小鼠麻醉恢復(fù)及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥情況。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)第24～28天，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。水迷宮直徑150 cm,高60 cm,放滿水，通過添加脫脂奶粉使其不透明，控制水溫25 ℃左右。在第一象限水面下1 cm設(shè)置平臺。將小鼠分別從水池4個(gè)象限放入水池中，開始計(jì)時(shí)，觀察并記錄小鼠從不同象限放入后找到平臺的時(shí)間，即逃避潛伏期時(shí)間。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn):將左半腦組織破碎后，使用RIPA緩沖液從腦組織中收集蛋白質(zhì),BCA法測定蛋白總濃度，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。使用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h,然后在4 ℃下分別與一抗(TREM2、iNOS、Arg-1、Aβ1-42、tau和β-actin)孵育過夜。用洗膜緩沖液(TBST)洗滌后將膜與山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL試劑盒)檢測免疫反應(yīng)性條帶，并使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

1.2.5 免疫熒光檢測:采用4%多聚甲醛將右半腦組織固定48 h后，石蠟切片，切片在磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST) (含0.1% Triton X-100/PBS) 中洗滌30 min,用5% 牛血清白蛋白(BSA)和10%正常驢血清阻斷60 min。LC3-Ⅱ/DAPI熒光標(biāo)記染色。切片首先與兔抗LC3-Ⅱ一抗孵育(1∶5 000),4 ℃過夜。隨后用PBS沖洗切片并孵育二抗(與紅色熒光團(tuán)結(jié)合的驢抗兔IgG)(1∶1 000),室溫孵育1 h。DAPI染色后使用hoechest33342染色。所有切片均在共聚焦顯微鏡下觀察。通過計(jì)算掃描軟件對陽性熒光個(gè)數(shù)進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 TREM2過表達(dá)促進(jìn)TBI大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞自噬

與sham組相比,TBI組大鼠腦組織TREM2表達(dá)水平升高，自噬標(biāo)記物(LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)表達(dá)水平升高,P62表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與TBI組相比,TBI并TREM2組大鼠腦組織TREM2表達(dá)水平升高，自噬標(biāo)記物(LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)表達(dá)水平升高,P62表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

A:TREM2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62免疫印跡條帶;B:TREM2表達(dá)水平量化;C:LC3Ⅱ表達(dá)水平量化;D:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平量化;E:P62表達(dá)水平量化;F:LC3Ⅱ免疫熒光陽性點(diǎn)斑數(shù);G:LC3Ⅱ免疫熒光和hoechest33342染色(綠色熒光標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核，黃色箭頭標(biāo)記自噬小體陽性點(diǎn)斑，放大倍數(shù)50倍)。與sham組比較,*P<0.05;與TBI組比較,#P<0.05。

2.2 TREM2治療改善了TBI大鼠學(xué)習(xí)記憶功能

在第28天的定位航行實(shí)驗(yàn)中，與sham組相比,TBI組大鼠逃避潛伏期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與TBI組相比,TBI并TREM2的逃避潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 TREM2過表達(dá)減少TBI誘導(dǎo)的Aβ1-42、tau蛋白表達(dá)

與sham組相比,TBI組Aβ1-42、tau蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與TBI組比,TBI并TREM2組Aβ1-42、tau蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

AD的神經(jīng)免疫情況非常復(fù)雜，相關(guān)研究[9-10]表明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞)在疾病中起關(guān)鍵作用。AD的疾病風(fēng)險(xiǎn)主要為TREM2突變功能喪失，促進(jìn)TREM2表達(dá)可能是治療AD的有效方法[4]。研究[11]表明，在骨髓細(xì)胞中異位表達(dá)TREM2后，將其體內(nèi)注射可以改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎。但直接的TREM2治療會(huì)發(fā)生毒性作用，因此可增加其表達(dá)或蛋白質(zhì)水平，使更多的TREM2可響應(yīng)適當(dāng)?shù)膬?nèi)源性刺激，這可能是治療AD和TBI后認(rèn)知功能障礙的方法[12]。本研究結(jié)果表明，大鼠TBI后腦組織中TREM2表達(dá)增加，體內(nèi)過表達(dá)TREM2 治療后,TBI介導(dǎo)的tau、Aβ1-42表達(dá)顯著減少，且認(rèn)知功能評分顯著提高，這說明促進(jìn)適量的TREM2表達(dá)可有益于治療TBI后認(rèn)知功能障礙。人類遺傳數(shù)據(jù)表明,TREM2在AD中發(fā)揮作用，但并未闡明在臨床AD階段激活TREM2和小膠質(zhì)細(xì)胞是否有益。TREM2可能只在淀粉樣蛋白積累的早期或預(yù)示著tau病理和神經(jīng)元喪失的淀粉樣蛋白積累早期，可增加小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，但一旦變性開始，此做法可能是有害的。因此，本研究選擇在TBI后立即干預(yù)TREM2表達(dá)。

既往研究[4]表明，在TREM2缺陷型AD小鼠中，最一致的表型是明顯缺乏小膠質(zhì)細(xì)胞活化。當(dāng)缺少TREM2時(shí)，淀粉樣蛋白在AD小鼠模型誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜被高度靜默[13]。此外，在小鼠腦中，與TREM2完整的小膠質(zhì)細(xì)胞相比,TREM2沉默小膠質(zhì)細(xì)胞，增加淀粉樣斑塊附近的細(xì)胞凋亡[14]。AD小鼠模型和AD患者的一個(gè)顯著特征是小膠質(zhì)細(xì)胞聚集在斑塊周圍，在神經(jīng)元和Aβ之間提供保護(hù)性屏障，從而防止神經(jīng)元營養(yǎng)不良[15]。小膠質(zhì)細(xì)胞可通過TREM2依賴性機(jī)制控制淀粉樣斑塊的結(jié)構(gòu)，并在斑塊和相鄰的神經(jīng)纖維之間形成屏障。在小膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)的區(qū)域，斑塊周圍營養(yǎng)不良軸突的形成減少了70%，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞和TREM2活性可減弱斑塊環(huán)境的神經(jīng)毒性[16-17]。

已知自噬與AD相關(guān)，沉默Beclin1基因可減少原代神經(jīng)元自噬，并增加AD模型中的Aβ沉積[18]。雷帕霉素介導(dǎo)的mTOR抑制可導(dǎo)致海馬Aβ42水平降低，并能通過增加自噬來改善記憶缺陷[19]。上述研究表明神經(jīng)元自噬在AD進(jìn)展中起保護(hù)作用。本研究表明,TREM2過表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自噬，與相關(guān)研究結(jié)果一致。本研究采用免疫熒光標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果表明TREM2過表達(dá)也可促進(jìn)TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞自噬反應(yīng)。但有研究[7]表明，TREM2在減弱小膠質(zhì)細(xì)胞自噬中發(fā)揮作用，TREM2抑制的小膠質(zhì)細(xì)胞含有更多的自噬囊泡。TREM2缺陷型小膠質(zhì)細(xì)胞自噬增加是由于小膠質(zhì)細(xì)胞試圖用自噬作為生存機(jī)制補(bǔ)償mTOR缺陷。從TREM2沉默小鼠中發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞的mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受損,TREM2維持小膠質(zhì)細(xì)胞處于高代謝狀態(tài)是通過增強(qiáng)mTOR途徑激活[20]。研究[21]表明，小膠質(zhì)細(xì)胞通過清除髓鞘和細(xì)胞碎片等神經(jīng)元源性成分來維持大腦穩(wěn)態(tài)，保護(hù)神經(jīng)功能。研究[22]提出，大鼠TBI后，靶向小膠質(zhì)細(xì)胞自噬可能為治療腦外傷的一種策略。

綜上所述,TREM2過表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬來改善TBI后認(rèn)知功能障礙。