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        超高效液相色譜-波長切換法同時測定健脾丸(濃縮丸)中4種成分的含量

        2021-05-18 10:29:40倫志彩羅兆亮
        食品與藥品 2021年2期

        鄭 昆,倫志彩,羅兆亮

        (1.日照市中醫(yī)醫(yī)院,山東 日照 276800;2.莒縣中醫(yī)醫(yī)院,山東 莒縣 276599;3.臨沂萊博醫(yī)藥技術(shù)有限公司,山東 臨沂 276017)

        健脾丸(濃縮丸)是由黨參、炒白術(shù)、陳皮、枳實(炒)、炒山楂和炒麥芽六味中藥組成的中藥制劑,其功能主治為健脾開胃,用于脾胃虛弱,脘腹脹滿,食少便溏[1]。其中黨參具有健脾益肺,養(yǎng)血生津作用[2];炒白術(shù)具有健脾益氣,燥濕利水,止汗,安胎作用[2]。陳皮和枳實具有理氣健脾,破氣消積,化痰散痞作用。健脾丸是臨床常用的中藥制劑,其濃縮丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊。經(jīng)查閱相關(guān)文獻[3-4],均以陳皮和枳實中共同存在的橙皮苷和柚皮苷等指標(biāo)成分的含量測定對健脾丸進行質(zhì)量控制[5-8]。目前,現(xiàn)有文獻中缺少對處方中黨參和白術(shù)的質(zhì)量控制方法。超高效液相色譜技術(shù)(UPLC)與傳統(tǒng)高效液相色譜(HPLC)相比,具有分析速度快、靈敏度高、節(jié)約流動相等優(yōu)點[9-11],尤其是對多組分樣品進行分析時,可顯著提高分析效率。本文以黨參和白術(shù)中4種特有成分黨參炔苷(黨參)、白術(shù)內(nèi)酯I、II、III(白術(shù))作為指標(biāo)成分,采用UPLC技術(shù),建立含量測定分析方法,對健脾丸中的黨參和白術(shù)進行質(zhì)量分析,從而控制健脾丸的質(zhì)量。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        Agilent1290型超高效液相色譜儀,配有二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱(美國Agilent公司);Meteler XP205型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);KQ-600DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);A10型超純水機[密理博(中國)有限公司]。

        1.2 試藥

        黨參炔苷對照品(批號:111732-201908,純度100 %),白術(shù)內(nèi)酯I對照品(批號:111975-201501,純度99.9 %),白術(shù)內(nèi)酯II對照品(批號:111976-201501,純度99.9 %),白術(shù)內(nèi)酯III對照品(批號:111978-201501,純度99.9 %,中國食品藥品檢定研究院);健脾丸(規(guī)格:濃縮丸,每8丸相當(dāng)于原生藥3 g,批號:191104,19110202,191004,仲景宛西制藥股份有限公司);甲醇(色譜純,德國Merck公司);乙腈(色譜純,德國Merck公司);乙酸(色譜純),超純水(實驗室自制)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱為Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);流速為0.5 ml/min;檢測波長為270 nm(0~13.5 min,檢測黨參炔苷和白術(shù)內(nèi)酯III)和220 nm(13.5~25 min,檢測白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯II);柱溫為30 ℃;進樣量為5 μl;流動相為乙腈(A)-0.1 %乙酸(B),梯度洗脫:0~9 min,20 %A~50 %A;9~16 min,50 %A~55 %A;16~25 min,55 %A~100 %A。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 供試品溶液 取本品,研碎,精密稱取約2.0 g,置錐形瓶中,精密加入甲醇100 ml,稱定重量,加熱回流提取1 h,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.2 對照品溶液 精密稱取黨參炔苷照品101.57 mg,白術(shù)內(nèi)酯I對照品16.43 mg,白術(shù)內(nèi)酯II對照品10.67 mg,白術(shù)內(nèi)酯III對照品18.61 mg,分別置于10 ml量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為各對照品儲備溶液;分別精密量取各對照品儲備溶液1 ml,置同一100 ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.3 陰性樣品溶液 按《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊中收載健脾丸(濃縮丸)的處方制法,分別制備不含黨參與不含白術(shù)的陰性樣品,然后按供試品溶液的制備方法,分別制備缺少黨參陰性樣品溶液和缺少白術(shù)陰性樣品溶液。

        2.3 專屬性試驗

        分別取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、缺黨參陰性樣品溶液與缺白術(shù)陰性樣品溶液,按2.1項下色譜條件進樣測定,色譜圖見圖1。結(jié)果各成分色譜峰峰形對稱,分離度良好。在缺少黨參陰性樣品溶液和缺少白術(shù)陰性樣品溶液色譜圖中4種待測成分相應(yīng)保留時間處沒有其他色譜峰,說明不存在其他成分的干擾。

        圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

        2.4 線性關(guān)系試驗

        取2.2.2項下對照品儲備溶液0.1,0.5,1.0,1.5,2.0 ml,分別置100 ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制得各對照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按2.1項下色譜條件進樣測定,以各對照品溶液的濃度(x,μg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),進行線性回歸,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)(r)結(jié)果見表1。

        表1 4種待測成分回歸方程及線性范圍

        2.5 精密度試驗

        精密量取2.2.2項下對照品溶液,按2.1項下色譜條件進樣測定,連續(xù)測定6次,記錄4種待測成分峰面積的RSD分別為1.17 %,1.04 %,1.28 %和1.05 %,表明方法精密度良好。

        2.6 穩(wěn)定性試驗

        取本品(批號:191104),按2.2.1項下方法制備供試品溶液,分別于0,4,8,12,24 h進樣,記錄4種待測成分色譜峰面積。結(jié)果4種成分峰面積的RSD分別為1.33 %,1.42 %,1.26 %,1.34 %,表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.7 重復(fù)性試驗

        取本品(批號:191104),按2.2.1項下方法制備供試品溶液,共6份,分別進樣測定,記錄各成分色譜峰面積并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算其含量。結(jié)果,4種成分含量的RSD(n=6)分別為1.52 %,1.35 %,1.67 %,1.82 %,表明方法重復(fù)性良好。

        2.8 回收率試驗

        取已知含量的樣品(批號:191104),精密稱取1.0 g,共6份,置錐形瓶中,分別精密加入4種待測成分對照品貯備溶液各0.5 ml,按2.2.1項下方法制備供試品溶液,進樣測定,計算4種待測成分的回收率。結(jié)果見表2。

        表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

        2.9 耐用性試驗

        取2.2項下供試品溶液,分別改變高效液相色譜儀(Agilent 1290和LC20A)、色譜柱型號[Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm)和Accucore C18(4.6 mm×100 mm,2.6 μm)]、柱溫(30 ℃、40 ℃和室溫)和流速(0.45,0.5,0.55 ml/min)等條件,考察其對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明,在上述范圍內(nèi)改變色譜條件,各色譜峰的分離度良好,表明本方法的耐用性良好。

        2.10 樣品測定

        取健脾丸3批,按2.2.1項下方法制備供試品溶液,進樣測定,計算各成分的含量,結(jié)果見表3。不同批次產(chǎn)品的含量基本一致,說明本藥在不同批次間的質(zhì)量較為穩(wěn)定。

        表3 含量測定結(jié)果(n=2)

        3 討論

        3.1 流動相的選擇

        本試驗比較了分別以甲醇-水與乙腈-水作為流動相的洗脫效果。選擇甲醇-水作為流動相時,黨參炔苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度較差,且白術(shù)內(nèi)酯III色譜峰峰形較差,色譜系統(tǒng)的壓力較高,對色譜柱不利。選擇乙腈-水作為流動相時,色譜系統(tǒng)壓力較低,有利于保護色譜柱,黨參炔苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度較好,為了改善色譜峰的峰形,在水中加入0.1 %乙酸,此時各待測成分色譜峰峰形對稱,因此,本試驗選擇乙腈-0.1 %乙酸溶液作為流動相。

        3.2 檢測波長的選擇

        本試驗采用二極管陣列檢測器,掃描4種待測成分的紫外吸收曲線(見圖2),發(fā)現(xiàn)黨參炔苷和白術(shù)內(nèi)酯III在270 nm波長處具有較強紫外吸收,白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯II在220 nm波長處具有較強紫外吸收,為了提高各成分的響應(yīng)值,提高檢測靈敏度,本文采用檢測波長切換法,分別選擇270 nm(0~13.5 min,檢測黨參炔苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ)和220 nm(13.5~25 min,檢測白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯II)作為4種待測成分的檢測波長。

        圖2 不同檢測波長HPLC圖譜

        健脾丸(濃縮丸)是《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中收載的中成藥制劑,該藥在臨床使用中用量較大,現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和已發(fā)表的文獻僅對組方中陳皮和枳實進行質(zhì)量控制,缺少對黨參和白術(shù)的質(zhì)量控制。本文采用UPLC,以黨參和白術(shù)為研究對象,對黨參和白術(shù)中4種成分進行含量測定,可有效控制該制劑中黨參和白術(shù)的質(zhì)量。本文研究方法重復(fù)性好,結(jié)果準(zhǔn)確,可為健脾丸(濃縮丸)質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

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