王鸞鸞，孫曉霞，王國(guó)偉，孫令驍，車(chē)國(guó)喜，劉香東，劉成虎

（山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

遺傳毒性試驗(yàn)主要通過(guò)檢測(cè)兩類(lèi)主要遺傳損傷：基因突變（點(diǎn)突變）和染色體損傷（結(jié)構(gòu)畸變等），來(lái)確定醫(yī)療器械（材料）或其浸提液等物理、化學(xué)和生物因素產(chǎn)生遺傳物質(zhì)損傷并導(dǎo)致遺傳性狀改變的能力。體外微核試驗(yàn)以微核作為遺傳毒性檢測(cè)終點(diǎn)，可用于染色體斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑的檢測(cè)，檢測(cè)終點(diǎn)明確，且方法簡(jiǎn)便、易于開(kāi)展，在食品、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域遺傳損傷的早期評(píng)價(jià)中得到廣泛應(yīng)用。本文根據(jù)GB/T 16886.12-2017中樣品制備方法，采用雙介質(zhì)制備一次性使用結(jié)扎夾的供試品溶液，同時(shí)采用細(xì)胞分裂阻滯法和流式細(xì)胞術(shù)法評(píng)價(jià)一次性使用結(jié)扎夾的遺傳毒性，對(duì)流式細(xì)胞術(shù)法和細(xì)胞分裂阻滯法的結(jié)果進(jìn)行比較，為流式細(xì)胞術(shù)在遺傳毒性體外微核檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的建立，提供可靠的依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

BSA822電子天平（Sartorius）；ZQZYCF振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚）；DP73正置顯微鏡（Olympus）；3-18KS臺(tái)式高速分冷凍離心機(jī)（Sigma）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（Beckman）。

1.2 材料

某公司生產(chǎn)的一次性結(jié)扎夾（批號(hào)1810020）；In Vitro MicroFlow Plus Kit（BD公司）；RPMI培養(yǎng)基（Hyclone）；新生牛血清（浙江天杭）；胰酶（Hyclone）；雙抗（Hyclone）；環(huán)磷酰胺（CP，Sigma）；絲裂霉素C（MMC，Sigma）；胞漿阻斷劑（CytoB，Sigma）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；姬姆薩染液（Sigma）。

1.3 細(xì)胞

中國(guó)倉(cāng)鼠肺（CHL）細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)于含10 %新生牛血清的RPMI培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。試驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4 代謝活化系統(tǒng)

哺乳動(dòng)物微粒體酶（S9）購(gòu)自Moltox分子毒理學(xué)股份有限公司，與輔助因子混合后使用，S9的終濃度為10 %，臨用前配制。

2 方法

2.1 供試品溶液制備[1]

按GB/T16886.12-2017的規(guī)定，按4 g/20 ml的比例，將一次性使用結(jié)扎夾分別置于0.9 %氯化鈉注射液（SC）和含血清細(xì)胞培養(yǎng)基中，于（37±1） ℃、60 r/min振蕩浸提（72±2）h，制備供試品溶液。介質(zhì)對(duì)照為不含供試品的SC和含血清細(xì)胞培養(yǎng)基，同法制備。陽(yáng)性對(duì)照為0.6 μg/ml MMC（無(wú)活化代謝系統(tǒng)短期接觸，-S9/6 h）、0.4 μg/ml MMC（無(wú)活化代謝系統(tǒng)長(zhǎng)期接觸，-S9/24 h）及60 μg/ml CP（活化代謝系統(tǒng)短期接觸，+S9/6 h）。

2.2 供試品溶液處理細(xì)胞[2]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHL細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，接種至6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，棄去培養(yǎng)基，分為-S9/6 h組、-S9/24 h組和+S9/6 h組。共孵育24 h后收獲細(xì)胞并進(jìn)行微核檢測(cè)。

2.3 細(xì)胞分裂阻滯法檢測(cè)

采用體外雙核試驗(yàn)，人工閱片檢驗(yàn)。在細(xì)胞分裂期前加入Cyto B（終濃度為5 μg/ml）以阻滯細(xì)胞質(zhì)分裂，形成雙核細(xì)胞，從而可在完成一次細(xì)胞分裂的細(xì)胞中進(jìn)行微核的識(shí)別及微核發(fā)生率的選擇性分析。閱片前用5 %姬姆薩染色。每組至少分析500個(gè)細(xì)胞，用復(fù)制指數(shù)（replication index，RI）評(píng)價(jià)供試品溶液的細(xì)胞毒性，試驗(yàn)用供試品溶液濃度為與陰性對(duì)照相比RI降低（45±5）%的濃度，試驗(yàn)組和對(duì)照組各分析2000個(gè)完整的雙核細(xì)胞。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

根據(jù)In Vitro MicroFlow Plus Kit試劑盒操作步驟進(jìn)行。采用疊氮溴化乙錠（EMA）和死細(xì)胞核酸染料（SYTOX Green）雙染料染色的方法區(qū)分凋亡、壞死和正常細(xì)胞，排除凋亡或壞死細(xì)胞對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。為保證需要的細(xì)胞都在邏輯門(mén)內(nèi)，在檢測(cè)前先用介質(zhì)對(duì)照調(diào)試模板，每組至少分析20 000個(gè)細(xì)胞。

2.5 結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，微核率比較使用Fisher精確概率法、四格表卡方檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞分裂阻滯法體外微核試驗(yàn)結(jié)果

含微核的雙核細(xì)胞實(shí)例見(jiàn)圖1。在有和無(wú)S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，所有試驗(yàn)組的RI均大于55 %，兩種介質(zhì)的雙核細(xì)胞微核率與介質(zhì)對(duì)照相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果均顯著高于介質(zhì)對(duì)照組（見(jiàn)表1），表明該供試品溶液無(wú)致誘變性。

表1 細(xì)胞分裂阻滯法體外微核試驗(yàn)結(jié)果

圖 1 含不同數(shù)目微核的雙核細(xì)胞實(shí)例

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

在有和無(wú)S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，SC供試品溶液（圖b1～3）和含血清培養(yǎng)基供試品溶液（圖b4～6）的細(xì)胞微核率與介質(zhì)對(duì)照（圖a1～6）相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照（圖c1～3）與介質(zhì)對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明該供試品溶液無(wú)致誘變性。各組微核率的數(shù)值見(jiàn)表2。

表 2 流式細(xì)胞術(shù)體外微核結(jié)果

4 討論

體外微核試驗(yàn)是檢測(cè)醫(yī)療器械是否有遺傳毒性的重要方法之一[3]。目前流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外微核的CHO細(xì)胞試驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)較多[4-6]，但CHL細(xì)胞的相關(guān)數(shù)據(jù)很少。本實(shí)驗(yàn)室已根據(jù)YY/T 0870.6-2019，采用CHL細(xì)胞分裂阻滯法檢測(cè)微核，并在本研究中首次將流式細(xì)胞術(shù)體外微核檢測(cè)應(yīng)用于醫(yī)療器械的遺傳毒性檢測(cè)，獲得CHL細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)體外微核試驗(yàn)數(shù)據(jù)，填補(bǔ)了該方法在醫(yī)療器械檢測(cè)應(yīng)用中的空白。

根據(jù)GB/T 16886.12-2017的規(guī)定，一次性使用結(jié)扎夾屬于不規(guī)則固體產(chǎn)品，選擇0.2 g/ml的浸提比例，選用（37±1）℃，（72±2）h，60 r/min條件下浸提，用于遺傳毒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，每組的RI值顯示此一次性結(jié)扎夾沒(méi)有細(xì)胞毒性，故只對(duì)100 %濃度供試品溶液進(jìn)行分析。細(xì)胞分裂阻滯法結(jié)果顯示，無(wú)S9陽(yáng)性對(duì)照（MMC作為陽(yáng)性對(duì)照物）的微核率是陰性對(duì)照的3倍左右，有S9時(shí)陽(yáng)性對(duì)照（CP作為陽(yáng)性對(duì)照物）的微核率約為陰性對(duì)照的4倍，表明該方法體系的合理性。每組微核率與介質(zhì)對(duì)照相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀術(shù)結(jié)果顯示，無(wú)S9陽(yáng)性對(duì)照（MMC作為陽(yáng)性對(duì)照物）的微核率是陰性對(duì)照的4倍左右，有S9時(shí)陽(yáng)性對(duì)照（CP作為陽(yáng)性對(duì)照物）的微核率約為陰性對(duì)照的5倍，體系成立。在有和無(wú)S9的情況下，兩種供試品溶液的微核率與對(duì)照相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且微核率與細(xì)胞分裂阻滯法檢測(cè)結(jié)果一致，即此供試品溶液在本試驗(yàn)條件下對(duì)CHL細(xì)胞無(wú)誘變性。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

本研究根據(jù)GB/T16886.3-2019中遺傳毒性檢測(cè)方法進(jìn)行，細(xì)胞分裂阻滯法和流式細(xì)胞術(shù)兩種體外微核檢測(cè)方法在有和無(wú)活化代謝系統(tǒng)條件下，一次性使用結(jié)扎夾的試驗(yàn)結(jié)果一致，與介質(zhì)對(duì)照相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，陽(yáng)性組的微核率為介質(zhì)對(duì)照的3～5倍，表明兩種方法均可應(yīng)用于醫(yī)療器械遺傳毒性的檢測(cè)。細(xì)胞分裂阻滯法人工閱片首先要識(shí)別雙核細(xì)胞，然后判斷微核[7]。雙核細(xì)胞中無(wú)論有一個(gè)微核還是多個(gè)微核（圖1），在計(jì)數(shù)發(fā)生畸變的細(xì)胞時(shí)都按一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)。人工讀片容易受閱片人的專(zhuān)業(yè)知識(shí)、日常積累的經(jīng)驗(yàn)及主觀因素的影響。相比于細(xì)胞分裂阻滯法，流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)雙熒光法檢測(cè)，先用EMA染色凋亡或壞死的細(xì)胞，然后經(jīng)RNA酶及細(xì)胞膜裂解液處理后，標(biāo)記SYTOX Green，該方法更具有客觀性，采用EMA和SYTOX Green雙染料染色的方法以區(qū)分凋亡、壞死和正常細(xì)胞，達(dá)到排除凋亡或壞死細(xì)胞對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，從而減少產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的幾率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性，能獲得更全面、可靠的遺傳毒性評(píng)價(jià)結(jié)果[8]；操作更簡(jiǎn)便；可減少人工閱片的誤差；檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量多，速度快，效率高；統(tǒng)計(jì)的樣本量大幅增加，評(píng)價(jià)結(jié)果更客觀；檢測(cè)結(jié)果更直觀，能提供多種細(xì)胞參數(shù)，可檢測(cè)細(xì)胞毒性，分辨出非整倍體畸變劑和誘變劑，分析細(xì)胞周期信息，遺傳毒性的作用方式[5]等。

隨著醫(yī)療器械使用范圍和應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)的增加，迫切需要更加客觀、科學(xué)的檢測(cè)手段來(lái)如實(shí)、準(zhǔn)確、快速地評(píng)價(jià)醫(yī)療器械遺傳毒性等生物安全性。本研究能為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供可靠依據(jù)，具有重要的參考價(jià)值。