狄 佳 張 軍 屈 偉 程 妍 常丹燕 鄭向紅&

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科1(710004) 消化內(nèi)科2

背景：隨著幽門螺桿菌(Hp)對抗菌藥物耐藥性和感染復(fù)發(fā)率的上升，高效清除Hp的難度日益增大。目的：探討過氧化氫(H2O2)建立的高氧環(huán)境對Hp的清除作用及其可能機制。方法：使用溶解氧測定儀測定體內(nèi)外條件下的H2O2溶液氧含量。以H2O2處理Hp標準菌株和野生型菌株；建立蒙古沙鼠Hp感染模型并予H2O2干預(yù)。紫外分光光度計檢測Hp生長情況；常量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)；Giemsa染色觀察胃黏膜Hp定植情況；透射電子顯微鏡和正苯基萘胺法觀察Hp細胞膜形態(tài)學(xué)及其滲透性變化。結(jié)果：水溶液和家兔胃液中添加H2O2后，溶液氧含量顯著升高(P均<0.05)。Hp在含H2O2液體培養(yǎng)基中的生長水平隨H2O2濃度升高而逐漸降低，直至完全不生長。蒙古沙鼠經(jīng)H2O2溶液灌胃14 d，胃黏膜定植的Hp數(shù)量接近于零。H2O2可誘導(dǎo)Hp細胞膜損傷、破裂，胞質(zhì)溢出，細胞膜滲透性顯著增高(P<0.05)。結(jié)論：H2O2能有效提高水溶液中的氧含量，在體內(nèi)外條件下均能對Hp發(fā)揮高效清除作用，其機制與菌體細胞膜損傷密切相關(guān)。

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種革蘭陰性微需氧彎曲棒狀桿菌，已被證實是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的主要致病因子，并與胃癌發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。目前全世界大部分國家和地區(qū)的人群存在不同程度的Hp感染，總體感染率超過50%(約44億)[3]?？咕幬锏膽?yīng)用是根除Hp感染的主要手段，但近年來隨著Hp對抗菌藥物耐藥性的顯著增加，根除成功率急劇下降，感染復(fù)發(fā)率迅速上升[4-5]。因此，尋求能高效清除Hp的新方法對于提高Hp感染的臨床治療水平以及預(yù)防胃癌等Hp相關(guān)疾病的發(fā)生具有重要意義。

作為一種專性微需氧菌，Hp對生長條件要求苛刻，其生長環(huán)境最適宜的氧含量約為5%～6%[6]。氧含量過高如大氣環(huán)境，或過低如厭氧環(huán)境，均易導(dǎo)致Hp死亡。由此，本課題組根據(jù)Hp的微需氧特性提出了一種通過建立高氧環(huán)境以清除Hp的全新思路：利用過氧化氫(H2O2)分解釋放氧氣來提高環(huán)境中的氧含量，以實現(xiàn)對Hp賴以生存的微需氧環(huán)境的有效破壞，從而促進Hp死亡，最終達到高效除菌的目的。本研究旨在探討H2O2是否能有效提高溶液中的氧含量，驗證H2O2在體內(nèi)外條件下對Hp的清除作用，并進一步探索除菌過程中Hp死亡的可能機制。

材料與方法

一、Hp菌株、實驗動物、主要試劑和儀器

Hp國際標準菌株ATCC43504(美國模式菌種收集中心)；Hp野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分離自就診于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)鏡中心、診斷為消化性潰瘍且13C-尿素呼氣試驗結(jié)果陽性患者的胃黏膜組織(倫理審批號：2016-1033)。

家兔由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2014-003；蒙古沙鼠由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(浙)2014-0001。

30% H2O2(廣州金華大化學(xué)試劑有限公司)；Hp專用液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；哥倫比亞綿羊血瓊脂培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific)；枸椽酸鉍鉀片/替硝唑片/克拉霉素片三聯(lián)藥物(麗珠維三聯(lián)?，麗珠集團麗珠制藥廠)；Giemsa染液(上海遠慕生物科技有限公司)；阿莫西林膠囊(金石寧?，國藥集團汕頭金石制藥有限公司)；正苯基萘胺(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；Triton X-100(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)。

溶解氧測定儀(WTW, Xylem Analytics Germany Sales GmbH & Co. KG.)；紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；普通光學(xué)顯微鏡(Olympus)；透射電子顯微鏡(Hitachi)；熒光酶標儀(Molecular Devices, LLC.)。

二、方法

1. 體外水溶液和家兔胃液氧含量測定

①體外水溶液氧含量測定：將30%H2O2與蒸餾水混合，分別配制成0.02、0.09、0.40、2.00 mg/mL H2O2溶液，以蒸餾水作為空白對照，溶解氧測定儀測定各組H2O2溶液氧含量。

②家兔胃液氧含量測定：將8只家兔隨機分為2組，每組4只。禁食24 h，麻醉后沿胃幽門處作一切口，插入溶解氧測定儀探針，使用縫合線將探針扎緊于胃幽門切口，另將十二指腸端扎緊。測定給藥前(0～10 min)胃液氧含量后，兩組分別吸取 0.5、1.0 mg/mL H2O230 mL注入胃內(nèi)，再次測定胃液氧含量。

2. Hp培養(yǎng)及其生長情況檢測：以Hp國際標準菌株ATCC43504為例，吸取1×108CFU/mL Hp菌液200 μL，以體積比1∶100分別加入含0.8、1.0、1.2 mg/mL H2O2的Hp專用液體培養(yǎng)基，同時設(shè)立空白對照組，置于37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，150 r/min微需氧環(huán)境下培養(yǎng)5 d，紫外分光光度計每日檢測液體培養(yǎng)基A600 nm。實驗重復(fù)3次。

3. 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concen-tration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)測定：MIC系指經(jīng)體外培養(yǎng)18～24 h后抑制細菌生長的最低藥物濃度，是測定抗菌藥物活性的重要指標[7]，MBC則是指殺死99.9%的細菌所需的最低藥物濃度[8]。本研究采用常量肉湯稀釋法測定MIC和MBC[9]。在1×108CFU/mL的Hp菌液中以體積比1∶100分別加入含倍數(shù)濃度H2O2的Hp專用液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，觀察液體培養(yǎng)基渾濁度。選取培養(yǎng)基清澈透明無細菌生長的最低H2O2濃度作為MIC。吸取上述清澈透明液體培養(yǎng)基100 μL，分別接種于哥倫比亞綿羊血瓊脂平板，微需氧條件下培養(yǎng)3 d，選取無菌落生長的最低H2O2濃度作為MBC。實驗重復(fù)5次。

4. 蒙古沙鼠Hp感染模型建立和干預(yù)：將60只蒙古沙鼠隨機分為6組，每組10只：空白對照組、Hp組、1、2、4 mg/mL H2O2組和三聯(lián)藥物組。后 5組禁食4 h后予1×108CFU/mL ATCC43504菌液15 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)20 d。Hp感染模型成功建立后，三組H2O2組分別予1、2、4 mg/mL H2O2水溶液15 mL/kg灌胃，三聯(lián)藥物組予三聯(lián)藥物混懸液(枸櫞酸鉍鉀25 mg/L，替硝唑2 mg/L，克拉霉素1 mg/L) 15 mL/kg灌胃，Hp組予蒸餾水15 mL/kg灌胃，均為每日1次，連續(xù)14 d。

5. 蒙古沙鼠胃黏膜Hp計數(shù)：蒙古沙鼠麻醉后處死，剪取大小約2 cm2的腺胃部分胃黏膜，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，Giemsa染色觀察胃黏膜完整性和Hp分布。于光學(xué)顯微鏡高倍視野(×1 000)下隨機選取5個視野計數(shù)Hp，每視野以1個點表示。每只實驗動物制作1張切片，每組共計50個點。

6. Hp細胞膜形態(tài)學(xué)觀察：使用透射電子顯微鏡觀察 H2O2(2 mg/mL)處理前后 ATCC43504菌株細胞膜超微結(jié)構(gòu)變化，以阿莫西林(0.04 mg/mL)處理作為陽性對照，蒸餾水處理作為空白對照。各組Hp給藥后孵育20 min，離心獲取1 mm3菌體沉淀，2.5%戊二醛前固定、1%鋨酸后固定，PBS沖洗后濃度梯度丙酮脫水(30%、50%、70%、80%、90%、100%)，無水丙酮/環(huán)氧樹脂以5∶1、3∶1、1∶3、1∶5比例包埋，切片后檸檬酸鉛-乙酸鈾雙染色，干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察。

7. 正苯基萘胺法測定Hp細胞膜滲透性：制備1×108CFU/mL ATCC43504菌液，隨機分為空白對照組、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL H2O2組和Triton X-100組(陽性對照)，并予相應(yīng)處理。吸取300 μL菌液，加入6 μL正苯基萘胺溶液(500 μmol/L)，混勻后加入黑色避光96孔板，每孔100 μL；在激發(fā)波長315 nm和發(fā)射波長400 nm條件下，以熒光酶標儀測定每孔相對熒光強度。實驗重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、H2O2對水溶液和家兔胃液氧含量的影響

空白對照組水溶液在37 ℃正常大氣條件下的氧含量為(6.72±0.56) μg/mL，與El-Sherif等[10]的報道(6.7～6.8 μg/mL)相一致。與空白對照組相比，0.02、0.09、0.40、2.00 mg/mL H2O2組水溶液氧含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，各組平均氧含量分別為空白對照組的1.17、1.36、2.22和3.97倍(圖1A)。

給藥前(0～10 min)家兔正常胃液氧含量為(3.65±0.48)μg/mL；注入H2O2溶液后(10～30 min)，0.5、1.0 mg/mL H2O2組胃液氧含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，兩組平均氧含量分別為正常胃液的4.17和5.15倍(圖1B)。

二、體外培養(yǎng)條件下H2O2對Hp的清除作用

Hp國際標準菌株ATCC43504的生長曲線呈對數(shù)形態(tài)。培養(yǎng)5 d后，0.8、1.0 mg/mL H2O2組A600 nm與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均> 0.05)，1.2 mg/mL H2O2組A600 nm則較空白對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖2A)。3株Hp野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ培養(yǎng)5 d后A600 nm變化趨勢與ATCC43504相似(圖2B-2D)。

與空白對照組(A)或0～10 min正常胃液(B)比較，*P<0.05，**P<0.01

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

H2O2對ATCC43504和野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的MIC分別為(1.75±0.35)、(0.65±0.15)、(1.10±0.50)、(0.95±0.45) mg/mL，MBC分別為(2.10±0.70)、(1.55±0.85)、(2.05±1.15)、(2.30±0.90) mg/mL。

三、H2O2對動物體內(nèi)Hp的清除作用

各組蒙古沙鼠胃黏膜組織Giemsa染色顯示，Hp組細菌數(shù)量較空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明Hp感染模型建立成功。1、2、4 mg/mL H2O2組與空白對照組相比，Hp數(shù)量未見明顯增加(P均>0.05)，表明H2O2能有效清除Hp；三聯(lián)藥物組Hp數(shù)量則較空白對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明清除效果不理想(圖3)。

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

四、H2O2對Hp細胞膜的作用

透射電子顯微鏡觀察顯示，空白對照組Hp菌體細胞膜完整且透明，胞質(zhì)均勻分布；H2O2組菌體細胞膜損傷、破裂、模糊不清，胞質(zhì)溢出；阿莫西林組作為陽性對照，僅菌體細胞壁出現(xiàn)變形損傷，細胞膜完整(圖4)。

阿莫西林僅破壞Hp細胞壁，細胞膜完整(黑色箭頭示菌體細胞膜；比例尺：300 nm)

正苯基萘胺法細胞膜滲透性檢測顯示，0.5、1.0、2.0 mg/mL H2O2組相對熒光強度依次增高，且均明顯高于空白對照組，除0.25 mg/mL組外，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；Triton X-100組作為陽性對照，相對熒光強度明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖5)。上述發(fā)現(xiàn)表明，Hp細胞膜滲透性隨H2O2濃度增加而逐漸增高。

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

Hp作為一種典型的微需氧革蘭陰性桿菌，主要定植于人和動物的胃竇黏膜上皮表面和黏液底層。目前，質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合抗菌藥物仍是根除Hp感染的主要方法，根除治療方案主要包括標準三聯(lián)療法、鉍劑/非鉍劑四聯(lián)療法(伴同療法、序貫療法等)[11]。然而，由于Hp耐藥性等問題的存在，實現(xiàn)高效清除Hp的目標仍然十分困難。本研究利用Hp的微需氧特性，擬通過H2O2分解釋放氧氣的方式提高環(huán)境中的氧含量，最終誘導(dǎo)Hp死亡。

正常大氣條件下，37 ℃水溶液的氧含量約為6.8 μg/mL[12]；而在微需氧條件下，本課題組預(yù)實驗結(jié)果顯示，37 ℃水溶液的氧含量約為1.7～2.0 μg/mL。由于Hp定植于胃黏膜表面并被胃液包圍浸潤，可推斷胃液屬于適宜Hp生長的微需氧環(huán)境，即胃液氧含量也應(yīng)在1.7～2.0 μg/mL范圍內(nèi)。當環(huán)境中的氧含量超過5.0 μg/mL(15%V/V)時[6]，Hp因生存適應(yīng)能力達到極限而無法存活。本研究證實，在37 ℃正常大氣條件下，隨著H2O2濃度的增加(0.02～2.00 mg/mL)，水溶液中的氧含量隨之升高，達到7.86～26.67 μg/mL，遠遠超過Hp極限生存的氧含量5.0 μg/mL。同樣，家兔胃內(nèi)注入H2O2溶液(0.5和1.0 mg/mL)后，胃液氧含量也顯著升高，達到15.23和18.78 μg/mL，這一氧含量足以殺滅Hp。因此，H2O2在體內(nèi)外條件下釋放的氧含量均滿足高效清除Hp的要求。

Hp在含H2O2的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)5 d后，其生長狀態(tài)發(fā)生顯著變化，生長曲線呈現(xiàn)類似于“全”或“無”的趨勢。低濃度H2O2組的Hp生長曲線呈對數(shù)形態(tài)，近似于空白對照組，表明在該氧含量下Hp尚能正常生長；而高濃度H2O2組Hp生長趨勢差，曲線平緩，表明細菌無法生長甚至已死亡；中等濃度H2O2組的Hp生長曲線則多呈現(xiàn)先抑制、后生長的趨勢，表明其生長狀態(tài)介于抑制與正常之間。本研究結(jié)果顯示H2O2對Hp國際標準菌株ATCC43504和野生型菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的MIC上限為2.1 mg/mL，MBC上限為3.2 mg/mL，說明這些Hp菌株均對H2O2敏感，能被H2O2有效抑制和清除。本研究在體外條件下證實，H2O2建立的高氧環(huán)境對Hp這類微需氧菌具有廣譜高效的清除作用。

蒙古沙鼠是目前國際公認的適用于Hp感染研究的動物模型[13]，具有感染率高、定植菌量大、感染后組織學(xué)改變與人類相似等諸多優(yōu)點。本研究通過Giemsa染色證實，蒙古沙鼠感染Hp后胃黏膜中有大量細菌定植，表明模型建立成功。經(jīng)H2O2溶液連續(xù)灌胃14 d，各濃度H2O2組蒙古沙鼠胃黏膜Hp數(shù)量與空白對照組相比均無明顯增加，表明H2O2在體內(nèi)環(huán)境中同樣發(fā)揮了高效清除Hp的作用，與體外實驗結(jié)果一致。而三聯(lián)藥物組給藥14 d后胃黏膜中仍存在大量Hp，提示較之臨床常用于根除Hp的鉍劑與抗菌藥物組合，H2O2療效更為顯著。

H2O2為強氧化劑，如期望今后應(yīng)用于Hp感染的臨床治療，將其濃度控制在安全范圍內(nèi)以充分保證使用安全性十分必要。根據(jù)本研究體內(nèi)外除菌實驗結(jié)果，2 mg/mL是H2O2在蒙古沙鼠中清除Hp的適宜濃度。本課題組在預(yù)實驗階段分別通過急性毒性實驗和胃黏膜損傷實驗驗證了H2O2在體內(nèi)應(yīng)用的安全性。在急性毒性實驗中，接受2 mg/mL H2O2灌胃14 d的蒙古沙鼠和昆明小鼠全部存活，體質(zhì)量未見明顯減輕；胃黏膜損傷實驗證實經(jīng)10 mg/mL H2O2灌胃的昆明小鼠胃黏膜完整、未見損傷，而阿司匹林陽性對照組小鼠胃黏膜可見多發(fā)糜爛灶，表明濃度不超過10 mg/mL的H2O2經(jīng)口給藥不會損傷胃黏膜。上述證據(jù)表明2 mg/mL H2O2經(jīng)口給藥不會出現(xiàn)毒性反應(yīng)，且不會造成胃黏膜損傷，安全性良好。

本研究還探討了H2O2清除Hp的機制是否與菌體細胞膜損傷有關(guān)。透射電子顯微鏡觀察直接證實了2 mg/mL H2O2處理后的Hp細胞膜破壞嚴重，而阿莫西林陽性對照組僅有菌體細胞壁變形損傷，細胞膜保持完整。進一步利用正苯基萘胺與細胞膜磷脂結(jié)合產(chǎn)生藍色熒光的特點觀察Hp細胞膜滲透性的變化[14]，結(jié)果顯示相對熒光強度隨H2O2濃度增加呈現(xiàn)劑量依賴性上升趨勢，表明菌體細胞膜滲透性逐漸增高，間接證實了細胞膜破裂程度逐漸加重。

利用H2O2分解釋放氧氣的特點建立高氧環(huán)境，在體內(nèi)外條件下均可成功清除Hp。目前這一成果已申請國家發(fā)明專利(CN109223825A)，設(shè)想未來可將適宜濃度的H2O2制成多種劑型，如口服液、片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑等，從而實現(xiàn)科研成果的臨床轉(zhuǎn)化。然而，目前距H2O2成功應(yīng)用于臨床Hp根除治療還有相當大的距離，其藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥代動力學(xué)等研究均有待進一步深入。首先，除口服外，還需探究其他給藥途徑的可行性，如腹腔局部給藥、靜脈給藥等，并選擇最佳給藥方式；其次，應(yīng)明確H2O2發(fā)揮除菌作用的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)；最后，需闡明H2O2清除Hp的關(guān)鍵機制，驗證其發(fā)揮作用的具體分子靶點和相關(guān)信號通路。在進入臨床試驗前，需綜合評價上述研究數(shù)據(jù)對擬行的臨床試驗的支持程度，以確保安全。

綜上所述，本研究證實H2O2能有效提高水溶液中的氧含量，在體內(nèi)外條件下均能對Hp發(fā)揮高效清除作用，其機制與菌體細胞膜損傷密切相關(guān)。根據(jù)Hp的微需氧特性，通過提高環(huán)境氧含量誘導(dǎo)Hp死亡，最終達到高效除菌目的，這一方法從從全新角度解決Hp感染的清除問題，為臨床根除Hp提供了新思路和新選擇。