潘宜久 王連魁 熊 華,2#

寧波市杭州灣醫(yī)院消化內(nèi)科1(315336)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所2

背景：非甾體抗炎藥(NSAIDs)廣泛應(yīng)用于臨床。隨著內(nèi)鏡技術(shù)的進(jìn)步，NSAIDs相關(guān)小腸損傷越來越多見，但目前尚無明確有效的防治措施。目的：探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)與Th17細(xì)胞失衡在NSAIDs相關(guān)小腸損傷中的作用以及血管緊張素1-7 [Ang(1-7)]的保護(hù)效應(yīng)。方法：30只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和Ang(1-7)治療組，后兩組使用雙氯芬酸鈉誘導(dǎo)小腸損傷模型。5 d后處死大鼠，取小腸黏膜觀察大體和組織學(xué)損傷情況；以ELISA法和(或)免疫組化法檢測Ang(1-7)以及促炎和抗炎細(xì)胞因子水平；流式細(xì)胞術(shù)分析Treg、Th17細(xì)胞占CD4+ T細(xì)胞的比例。結(jié)果：模型組大鼠小腸黏膜廣泛充血、水腫，散在多發(fā)糜爛、小潰瘍。Ang(1-7)治療組小腸損傷明顯減輕，黏膜輕度充血、水腫，散在少量小糜爛灶。治療組小腸組織Ang(1-7)、抗炎細(xì)胞因子水平、Treg細(xì)胞數(shù)量和Treg/Th17比值較模型組顯著升高，抗炎細(xì)胞因子水平和Th17細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著降低(P均<0.05)。Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，小腸黏膜Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值呈顯著正相關(guān)(r=0.847, P<0.05)。結(jié)論：Treg/Th17失衡可能是NSAIDs相關(guān)小腸損傷的重要發(fā)病機(jī)制，而Ang(1-7) 可能通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡參與保護(hù)NSAIDs相關(guān)小腸損傷。

非甾體抗炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛等作用，廣泛應(yīng)用于臨床。隨著該類藥物臨床應(yīng)用的增多，其消化道不良反應(yīng)越來越受到人們的關(guān)注。NSAIDs相關(guān)胃腸道損傷可導(dǎo)致潰瘍、出血、穿孔等并發(fā)癥發(fā)生[1]。與胃十二指腸損傷不同，NSAIDs引起的小腸損傷癥狀多為非特異性甚至無癥狀[2]，因小腸損傷住院治療的患者多以出血、穿孔、梗阻等嚴(yán)重并發(fā)癥為首發(fā)表現(xiàn)。目前對NSAIDs相關(guān)小腸損傷尚無明確有效的防治措施，因此，迫切需要進(jìn)一步明確損傷發(fā)生機(jī)制，從而為其臨床防治尋找新的策略。

血管緊張素1-7 [angiotensin 1-7, Ang(1-7)]是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system)的新組分，可發(fā)揮舒張血管、降低血壓、增加局部血流量以及抗炎等作用。有研究[3]表明Ang(1-7)可顯著減輕小鼠結(jié)腸炎模型的結(jié)腸炎癥損傷，然而，關(guān)于Ang(1-7)對NSAIDs相關(guān)小腸損傷是否具有保護(hù)作用，目前尚無明確結(jié)論。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)與Th17細(xì)胞是一對免疫平衡細(xì)胞，正常情況下兩者處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Treg/Th17失衡在炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4-5]，例如在三硝基苯磺酸(TNBS)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型小鼠腸道中存在以Treg/Th17失衡為主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究通過構(gòu)建雙氯芬酸鈉誘導(dǎo)的NSAIDs相關(guān)小腸損傷大鼠模型，探討Treg/Th17失衡在NSAIDs相關(guān)小腸損傷中的作用以及Ang(1-7)的保護(hù)效應(yīng)，以期為NSAIDs相關(guān)小腸損傷的防治提供潛在靶點(diǎn)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Sprague-Dawley大鼠30只，8周齡，體質(zhì)量(200±20) g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號：2008001664294)，使用該中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠盒中，每籠5只，清潔級環(huán)境(溫度22～26 ℃，濕度50%～60%，適宜光照條件)，自由進(jìn)食、飲水，專人管理。

2. 主要試劑：雙氯芬酸鈉(Sigma-Aldrich?, Merck KGaA)；Ang(1-7)(Tocris Bioscience)；Ang(1-7)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-17A、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；Ang(1-7)兔抗鼠多克隆抗體(Cloud-Clone Corp.)；大鼠CD4 FITC、CD25 APC、CD4 APC、IL-17A PE單克隆抗體，小鼠/大鼠Foxp3 PE單克隆抗體，大鼠IgG2a κ PE同型對照，小鼠IgG2a κ APC同型對照(eBioscienceTM, Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 動(dòng)物分組和模型制備：采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠分為3組：對照組、模型組和Ang(1-7)治療組，每組10只。參考Cooper等[6]的方法使用雙氯芬酸鈉制備小腸損傷模型。將100 mg雙氯芬酸鈉溶于100 mL 0.9% NaCl溶液中，配制l mg/mL溶液，按10 mg·kg-1·d-1的劑量予大鼠連續(xù)灌胃5 d。Ang(1-7)治療組藥物劑量參考Tesanovic等[7]的研究，將 9.6 mg Ang(1-7)溶于1 mL滅菌水中，配制成9.6 μg/μL溶液，分別注入10只100 μL膠囊微泵中，于雙氯芬酸鈉灌胃造模前1 d將膠囊植入大鼠頸背部皮下，以24 μg·kg-1·h-1的速度持續(xù)皮下微泵給藥至造模結(jié)束。對照組予10 mL·kg-1·d-10.9% NaCl溶液灌胃，不作其他處理。5 d后處死各組大鼠，觀察腹腔內(nèi)有無出血、腹水，以及腹水性質(zhì)和腸道組織粘連情況。

2. 組織病理學(xué)檢查：分離大鼠小腸組織，肉眼觀察大體損傷情況。參考Murano等[8]采用的大體形態(tài)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)(表1)，評估腸黏膜潰瘍和炎癥程度。于距回盲部5 cm處向口側(cè)切取兩段2 cm長的小腸組織備用(肉眼觀有糜爛、潰瘍等病變的取病變及其周邊組織)，其中一份4%甲醛溶液固定，另一份置入凍存管后液氮保存，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱凍存待測。

表1 腸黏膜大體形態(tài)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

小腸組織標(biāo)本4%甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、3～4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。參考Chiu氏評分標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行小腸組織學(xué)損傷評分(表2)，每只動(dòng)物5張切片，每張切片隨機(jī)觀察4個(gè)高倍視野(×200)，結(jié)果取均值。

表2 腸黏膜組織學(xué)損傷Chiu氏評分標(biāo)準(zhǔn)

3. ELISA法檢測小腸組織Ang(1-7)和炎癥細(xì)胞因子水平：參照相應(yīng)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，以酶標(biāo)儀測定小腸組織Ang(1-7)、IL-6、IL-17A、IL-10、TGF-β1水平。

4. 免疫組化法檢測小腸組織Ang(1-7)表達(dá)：石蠟包埋小腸組織3～4 μm厚連續(xù)切片，行SP法免疫組化染色，操作步驟參照試劑說明書進(jìn)行。每只動(dòng)物5張切片，每張切片于光學(xué)顯微鏡高倍視野(×200)下選取3～5個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)200個(gè)以上細(xì)胞中的陽性染色細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性標(biāo)記指數(shù)(陽性標(biāo)記指數(shù)=視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%)，結(jié)果取均值。

5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測小腸黏膜Treg、Th17細(xì)胞比例：大鼠解剖后迅速取小腸黏膜，0.9% NaCl溶液清洗2～3次，立即置于預(yù)冷RPMI1640培養(yǎng)基中，剪碎、研磨、擠壓、過濾后得到單細(xì)胞懸液，預(yù)冷PBS洗滌后離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106/mL，參照試劑說明書進(jìn)行操作，上流式細(xì)胞儀(BD FACSCantoⅡ)檢測Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、腹腔和小腸組織大體觀察

對照組大鼠小腸黏膜光滑，無充血、水腫，無糜爛、潰瘍。模型組大鼠造模第3天死亡1只，解剖后見大量血性腹水和腸穿孔；其余大鼠小腸黏膜廣泛充血、水腫，散在多發(fā)糜爛、小潰瘍，偶見小穿孔，伴腸系膜淋巴結(jié)腫大，損傷多在系膜側(cè)。Ang(1-7)治療組大鼠小腸損傷明顯減輕，黏膜輕度充血、水腫，散在少量小糜爛灶，未見明顯潰瘍和穿孔。模型組大體損傷評分較對照組明顯升高，Ang(1-7)治療組評分則較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05；圖1、表3)。

圖1 各組大鼠小腸大體損傷

二、小腸組織病理學(xué)改變

對照組大鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)未見明顯缺損和異常，絨毛排列整齊。模型組大鼠小腸黏膜缺損，部分絨毛倒伏、缺失，上皮壞死嚴(yán)重，可見潰瘍，固有層水腫明顯，伴大量炎癥細(xì)胞浸潤。Ang(1-7)治療組大鼠小腸絨毛輕度水腫、增粗，偶見上皮層小缺損，固有層內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤。模型組組織學(xué)損傷評分較對照組明顯升高，Ang(1-7)治療組評分則較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05；圖2、表3)。

圖2 各組大鼠小腸組織病理學(xué)改變(HE染色，×100)

表3 各組大鼠小腸組織大體和組織學(xué)損傷評分比較

三、小腸組織Ang(1-7)表達(dá)水平變化

ELISA法和免疫組化法檢測顯示，模型組大鼠小腸組織Ang(1-7)含量和陽性標(biāo)記指數(shù)均較對照組明顯降低，Ang(1-7)治療組相應(yīng)數(shù)據(jù)則較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05；表4、圖3、圖4)，表明外源性Ang(1-7)干預(yù)可升高小腸組織中的Ang(1-7)表達(dá)水平。

表4 各組大鼠小腸組織Ang(1-7)表達(dá)水平比較

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01

圖4 各組大鼠小腸組織Ang(1-7)表達(dá)免疫組化染色圖

四、小腸組織炎癥細(xì)胞因子水平

ELISA法檢測顯示，模型組大鼠小腸組織IL-6、IL-17A水平較對照組明顯升高，IL-10、TGF-β1水平較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；Ang(1-7)治療組IL-6、IL-17A水平較模型組明顯降低，IL-10、TGF-β1水平較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05；表5、圖5)。

表5 各組大鼠小腸組織炎癥細(xì)胞因子水平比較

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

五、小腸黏膜Treg/Th17比值

流式細(xì)胞分析顯示，模型組大鼠小腸黏膜Treg、Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例均較對照組明顯增加，但Treg/Th17比值較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；Ang(1-7)治療組Treg細(xì)胞比例較模型組明顯升高，Th17細(xì)胞比例較模型組明顯降低，Treg/Th17比值較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05；表6、圖6)。

表6 各組大鼠小腸黏膜Treg、Th17細(xì)胞比例和Treg/Th17比值比較

圖6 各組大鼠小腸黏膜Treg、Th17細(xì)胞比例(流式細(xì)胞分析)

六、小腸組織Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值的相關(guān)性

Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，小腸黏膜組織中的Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值呈顯著正相關(guān)(r=0.847,P<0.05)。

討 論

NSAIDs在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用于急慢性炎癥，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療。其中阿司匹林因其穩(wěn)定的抗血小板凝集作用，已成為心腦血管疾病的一級預(yù)防用藥。此外，其對結(jié)直腸癌也有一定的預(yù)防作用[10]。然而，隨著該類藥物適應(yīng)證的擴(kuò)大，其不良反應(yīng)尤其是胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生率逐漸增加。早年由于檢查手段的限制，對NSAIDs相關(guān)胃腸道不良反應(yīng)的研究主要集中于胃十二指腸損傷，近年來，由于質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)、黏膜保護(hù)劑等的使用，胃十二指腸黏膜損傷的發(fā)生率明顯下降，但此類藥物對包括小腸在內(nèi)的下消化道損傷并無明確防治作用，甚至有研究表明，長期預(yù)防性使用PPIs可能通過影響腸道菌群增加小腸隱匿性出血和潰瘍發(fā)生率[11]。近年來，隨著內(nèi)鏡技術(shù)的進(jìn)步，如膠囊內(nèi)鏡的應(yīng)用，NSAIDs相關(guān)小腸損傷越來越多見，在長期服用NSAIDs的患者中，約50%存在小腸黏膜損傷[2]。而且，大部分NSAIDs相關(guān)腸病患者無臨床癥狀，需住院治療者多以出血、穿孔、梗阻等嚴(yán)重并發(fā)癥為首發(fā)表現(xiàn)。NSAIDs相關(guān)腸病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全明確，既往多聚焦于三級打擊學(xué)說、環(huán)氧合酶(COX)雙重抑制學(xué)說、NSAIDs的肝腸循環(huán)以及腸道菌群變化等方面[12]，目前臨床上缺乏有效的防治措施。因此，進(jìn)一步明確NSAIDs相關(guān)小腸損傷的發(fā)病機(jī)制是迫切需要解決的問題。

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞均由初始CD4+T細(xì)胞增殖分化而來，前者主要通過分泌IL-17A、IL-21等細(xì)胞因子參與機(jī)體自身免疫和炎癥反應(yīng)，后者則通過分泌IL-10、TGF-β1等細(xì)胞因子抑制免疫炎癥反應(yīng)，維持機(jī)體的免疫耐受。正常情況下兩者處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，對維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)起重要作用。維甲酸受體相關(guān)孤核受體γt(RORγt)和叉頭蛋白3(Foxp3)分別是參與調(diào)控Th17和Treg細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[13]，F(xiàn)oxp3缺乏可導(dǎo)致Treg細(xì)胞分化減少，從而引發(fā)過度免疫反應(yīng)，造成組織損傷。除促進(jìn)Th17細(xì)胞分化、產(chǎn)生大量IL-17A外，RORγt還可抑制T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，從而維持Th17細(xì)胞的致病性[14]。Treg/Th17平衡在不同疾病模型和病情階段存在不同的變化趨勢。綜合相關(guān)研究結(jié)果，在炎癥初發(fā)和進(jìn)展階段，機(jī)體和局部免疫水平上調(diào)，Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量均有不同程度的增加，整體上以Th17細(xì)胞增加為主，通過分泌IL-17A等促炎細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥發(fā)生、發(fā)展；至炎癥后期和修復(fù)階段，Th17細(xì)胞比例明顯降低，Treg細(xì)胞比例逐漸升高，通過分泌IL-10等抗炎細(xì)胞因子抑制炎癥持續(xù)，促進(jìn)機(jī)體和局部組織修復(fù)。近年已有一系列關(guān)于Treg/Th17平衡在炎癥性腸病等疾病中作用的研究發(fā)表[4-5,15]，但其與NSAIDs相關(guān)小腸損傷之間的關(guān)系尚無確切結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)，在雙氯芬酸鈉誘導(dǎo)的大鼠小腸損傷模型中，Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例顯著上升，盡管Treg細(xì)胞比例也較對照組升高，但Treg/Th17比值較對照組明顯下降，表明NSAIDs相關(guān)小腸損傷時(shí)存在Treg/Th17失衡。模型組大鼠小腸組織IL-6、IL-17A表達(dá)升高，IL-10、TGF-β1表達(dá)降低，表明在NSAIDs相關(guān)小腸損傷中，Treg/Th17失衡致促炎/抗炎細(xì)胞因子失衡，進(jìn)而促進(jìn)炎癥進(jìn)展，造成組織損傷。

Ang(1-7)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的新組分，具有明顯的抗炎效應(yīng)，可減輕結(jié)腸炎、哮喘等疾病動(dòng)物模型的炎癥程度[3,16-17]。Ang(1-7)在體內(nèi)主要由AngⅡ水解產(chǎn)生，與其特異性受體MAS結(jié)合后發(fā)揮抗炎、舒張血管、降低血壓等與AngⅡ相反的生物學(xué)功能，因而被認(rèn)為是AngⅡ的內(nèi)源性拮抗劑[18-19]。本研究予模型大鼠外源性Ang(1-7)干預(yù)，探究Ang(1-7)在NSAIDs相關(guān)小腸損傷中的作用及其可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)Ang(1-7)干預(yù)的模型大鼠小腸組織Ang(1-7)表達(dá)水平明顯升高，大體和組織學(xué)損傷較模型組明顯減輕，Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例以及IL-6、IL-17A水平亦較模型組明顯降低，同時(shí)Treg細(xì)胞比例、Treg/Th17比值以及IL-10、TGF-β1水平較模型組明顯升高，且小腸組織中的Ang(1-7)含量與Treg/Th17比值呈顯著正相關(guān)，表明Ang(1-7)對NSAIDs相關(guān)小腸損傷具有保護(hù)作用，此種保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡有關(guān)，相關(guān)信號通路和分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs相關(guān)小腸損傷時(shí)存在Treg/Th17失衡，這可能是NSAIDs相關(guān)小腸損傷的重要發(fā)病機(jī)制；Ang(1-7)對NSAIDs相關(guān)小腸損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡有關(guān)，Treg/Th17平衡可能是防治NSAIDs相關(guān)小腸損傷的潛在靶點(diǎn)。后續(xù)研究擬通過干預(yù)Treg/Th17相關(guān)細(xì)胞因子，為NSAIDs相關(guān)腸病的臨床治療提供新的思路。