李納

摘要：目的：分析EB病毒感染與宮頸癌的關系，探尋P16在宮頸癌中的表達情況，初步揭示P16和EB病毒感染的相關關系，以及與患者臨床病理學特征的關系。方法：免疫組化法檢測100例宮頸癌患者石蠟標本和30例正常的宮頸標本中P16表達水平，用原位雜交CISH顯色技術，檢測兩組標本的EB病毒的陽性率，進而分析宮頸癌中EB病毒的感染率與P16表達的相互關系。結果：EB病毒陽性表達率在宮頸癌為37 %，正常宮頸組中未檢測到EB病毒，兩組間的差異有顯著性（P < 0.05） 。P16在兩組的陽性表達率分別為87 %和13.3 %，兩組間的差異有顯著性（P < 0.05） ，低分化癌中P16+EBV陽性率為41.67 %，與中高分化的宮頸癌相比較，差異有顯著性（P ﹤ 0.05） 。結論：宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，EB病毒的感染影響了P16的異常表達，二者可能共同參與宮頸癌的惡性程度病變。但可能沒有直接參與宮頸癌細胞的浸潤和擴散。

關鍵詞：宮頸癌;P16蛋白;EB病毒;原位雜交CISH;免疫組化

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來，宮頸癌的發(fā)病率逐年升高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。在炎性細胞的持續(xù)刺激下，宮頸正常細胞周期調(diào)節(jié)逐漸失控，抑癌基因過度表達，細胞凋亡紊亂，出現(xiàn)不斷的惡性增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移 [2]。本研究目的是，在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中，EB病毒的感染是否影響了P16蛋白的表達，從而引起細胞周期調(diào)節(jié)失控，共同參與宮頸癌的惡化進展，為闡明二者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的意義及相關關系提供更充分的科學依據(jù)?，F(xiàn)報道如下：

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取廣東省中山市小欖人民醫(yī)院2017～2021年收治宮頸癌手術患者的癌組織石蠟標本100例為一組，正常宮頸標本30例為一組。年齡30～66歲，平均年齡為（45. 28±7. 85） 歲。納入標準：經(jīng)組織病理學檢查確診為慢性宮頸炎且未見宮頸病變。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05） ，具有可比性。本次研究是利用以往臨床診療中的石蠟標本采集獲得，申請了免除受試者知情同意，已獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 免疫組織化學和EB原位雜交

所有蠟塊均經(jīng)10 %福爾馬林固定，常規(guī)取材，石蠟包埋，切4 μm厚度，與陽性片同置粘附載玻片，60度烘烤1.5小時。用Dako Envision FLEX PTlink48預處理和AutostainerLink48自動染色系統(tǒng)（修復液和免疫顯色試劑均購自廣州寶迪科技有限公司） ，按說明書檢測。EBER雜交試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司） ，按說明書檢測。

1.3 評分標準

P16蛋白的表達以細胞核呈清晰的棕色或細胞核、細胞漿同時呈棕色為陽性，每例隨機數(shù)10個高倍視野，平均每100個瘤細胞中陽性細胞數(shù)在25以上;EB病毒鏡下以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每例隨機數(shù)10個高倍視野，平均每100個瘤細胞中陽性細胞數(shù)在10以上。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析正常宮頸、宮頸癌P16和EB病毒陽性率，析因分析EB病毒感染與P16在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中是否存在協(xié)同作用，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 P16蛋白檢測率

宮頸癌P16的陽性率87 %（87/100） ，高于正常13.3 %（4/30） ，差異有統(tǒng)計學意義（χ2 = 96.053，P ﹤ 0.01） 。Ⅰ 期和Ⅱ期P16陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05） ;低分化、有淋巴結轉(zhuǎn)移宮頸癌P16陽性率均高于中高分化、無淋巴結轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P ﹤ 0.05） ，見表1。

2.2 EB病毒檢測率

正常宮頸未檢測到EB病毒，宮頸癌中EB病毒陽性率37 %（37/100） ，差異有顯著性（χ2 = 152.837，P ﹤ 0.01） 。淋巴結轉(zhuǎn)移及宮頸癌分期患者中EB病毒的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05） ;低分化癌中的陽性率高于中高分化的宮頸癌患者，差異有統(tǒng)計學意義（P ﹤ 0.05） ，見表1。

2.3 P16+EBV陽性檢測率

宮頸癌Ⅰ期P16+EBV陽性率為21.73 %，與Ⅱ期比較差異無顯著性（P > 0.05） ;淋巴結有轉(zhuǎn)移者陽性率33.33 %，與無轉(zhuǎn)移比較，差異無顯著性（P ﹤ 0.05） ;低分化癌P16+EBV陽性率為41.67 %，與中高分化相比，差異有顯著性（P ﹤ 0.05） ，見表2。

3 討論

十年來我國宮頸癌患病率由15.1/10萬升到 43.3/10萬，而2019年廣東省女性宮頸癌為49.8/10萬，遠高于全國水平[3]。宮頸癌病因復雜，與年齡、受教育程度、自我保護意識、衛(wèi)生條件、性生活史、生殖道感染、生活習慣以及情緒壓力等因素均相關[4]。P16位于人類染色體9p21，是周期蛋白依賴性激酶抑制因子，通過抑制細胞周期依賴激酶4和6，促進視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F連接，抑制惡變細胞增殖和分化[5～6]。隨著宮頸細胞惡變，P16常出現(xiàn)過表達[7]。本次實驗宮頸癌P16陽性為87 %（87/100） ，明顯高于正常宮頸13.3 %（4/30） ，惡性越高且轉(zhuǎn)移的患者P16表達程度越高，提示P16參與了宮頸癌的進展與轉(zhuǎn)移，與以往研究相符。EB病毒是一種嗜人類淋巴細胞的γ-1型的皰疹病毒，可以感染T和B或NK細胞，與眾多腫瘤的發(fā)生有關[8]。EB病毒可輔助誘導宮頸癌發(fā)生，在CIN中感染較為常見，特別是CIN3和宮頸癌[9]。SLAWA 等研究表明感染EB病毒可能參與HPV16基因整合并且有助于宮頸癌的發(fā)展[10]。有研究肺鱗癌EBER（+） 組，EB病毒感染通過改變P16導致肺上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化[11]。EB病毒感染的胃癌患者，P16基因啟動子區(qū)域CpG島高甲基化，導致其表達缺失[12]。P16作為 HPV 病毒感染比較特異的作用位點研究已較明確[13]，但宮頸癌中 EB 和P16的關系尚不明確。本次實驗發(fā)現(xiàn)，正常宮頸沒有EB感染，宮頸癌EB陽性率為37 %（37/100） ，提示分化程度越低，感染率越高。低分化癌P16+EBV陽性率與中高分化相比，差異有顯著性，分析EB病毒受體并非B細胞表面獨有，可存在宮頸上皮細胞中，EB感染可能干擾了P16基因狀態(tài)，影響P16正常表達，二者共同促進病變及癌細胞的發(fā)生發(fā)展。但宮頸癌分期以及癌轉(zhuǎn)移中，P16與EB感染陽性之間的差異無統(tǒng)計學意義，表明EB病毒感染沒有直接參與宮頸癌浸潤和轉(zhuǎn)移，可能與其他因子共同作用，協(xié)同促進宮頸癌浸潤與擴散。

綜上所述，EB病毒的感染可能參與干擾了P16的基因正常狀態(tài)，二者共同促進了宮頸細胞惡性病變及發(fā)生發(fā)展，但需要其他因子的協(xié)同作用，與P16共同參與宮頸癌細胞的浸潤擴散和遠處轉(zhuǎn)移。

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