代永聯(lián)，郝小靜，衣服德，白光燁，檀學(xué)進(jìn)，馮永勝

(青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100)

動(dòng)物和人類都能感染志賀菌，感染后會(huì)出現(xiàn)腹瀉等一系列癥狀，通常人們將志賀菌劃分為4 個(gè)群，A 群痢疾志賀菌、B 群福氏志賀菌、C 群鮑氏志賀菌和D 群宋內(nèi)志賀菌[1]。宋內(nèi)志賀菌是導(dǎo)致禽類細(xì)菌性痢疾的主要病原菌之一，目前主要使用抗菌藥物防治禽類宋內(nèi)志賀菌性痢疾，但由于細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，多數(shù)抗菌藥物的防治效果差。大量使用抗生素，一方面會(huì)由于細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、藥物副作用大對(duì)畜禽健康造成危害，另一方面畜禽產(chǎn)品的藥物殘留會(huì)直接影響人類的食品安全。噬菌體廣泛存在于自然環(huán)境中，具有較強(qiáng)的特異性，可在特定細(xì)菌內(nèi)增殖，裂解細(xì)菌，達(dá)到殺滅和清除細(xì)菌的目的。噬菌體在耐藥性細(xì)菌防治上具有很好的效果，無(wú)副作用，無(wú)藥物殘留，安全綠色，利于畜禽健康養(yǎng)殖。開(kāi)展家禽宋內(nèi)志賀菌性痢疾噬菌體的研究，對(duì)相關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和噬菌體來(lái)源

宋內(nèi)志賀菌菌種從發(fā)病雞分離純化取得，由上海派森諾基因科技有限公司經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定；噬菌體分離自青島某雞場(chǎng)污水。

1.1.2 試劑

SM 懸浮液；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)半固體、固體、液體培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基；磷鎢酸(pH 6.7，濃度2%)；氯化鈉等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離

取30 mL 污水加入100 mL 滅菌NB 培養(yǎng)基，加入0.6 mL 對(duì)數(shù)期宋內(nèi)志賀菌菌液，36 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，取出靜置60 min，12 000 r/min離心10 min，用0.22 um 濾膜過(guò)濾上清液，取得噬菌體原液。取0.2 mL 噬菌體原液與0.2 mL 對(duì)數(shù)期宋內(nèi)志賀菌菌液均勻混合，室溫靜置15 min，使細(xì)菌表面均勻吸附噬菌體，與7 mL 56 ℃的NA 半固體培養(yǎng)基均勻混合，迅速倒入NA 固體培養(yǎng)基上制成雙層平板，凝固后將平板倒置，36 ℃培養(yǎng)16 h，觀察噬菌斑。

1.2.2 噬菌體純化

挑取中間透亮、直徑約2 mm 的單個(gè)噬菌斑，移入1 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃水浴30 min,使噬菌體充分逸出，然后按“1.2.1噬菌體分離”介紹的方法離心過(guò)濾，與0.2 mL對(duì)數(shù)期宋內(nèi)志賀菌菌液等量混合均勻，移入2 mL 液體NA 培養(yǎng)基中。依次純化5 次，獲得高純度的噬菌體。

1.2.3 噬菌體觀察

在專用銅網(wǎng)上滴加效價(jià)為1×109PFU/mL的噬菌體20 uL，室溫放置20 min，用濾紙吸除多余的液體，1.5%磷鎢酸負(fù)染15 min～20 min，吸除多余染色液并自然干燥，透射電鏡下觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.4 噬菌體生物學(xué)特性觀察及效價(jià)測(cè)定

用無(wú)菌生理鹽水將0.2 mL 純化的噬菌體按10-1～10-9濃度梯度稀釋，每個(gè)濃度分別取0.2 mL，加入0.2 mL 菌液混合均勻，按“1.2.1噬菌體分離”介紹的方法鋪NA 雙層板，每個(gè)濃度的噬菌體做3 個(gè)平行，觀察噬菌斑情況。取濃度適當(dāng)、噬菌斑數(shù)量在30～300 個(gè)之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，以3 個(gè)平行板的噬菌斑計(jì)平均數(shù)，計(jì)算噬菌體效價(jià)(PFU/mL=稀釋倍數(shù)×平均板數(shù)×5)。

1.2.5 測(cè)定噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

取宋內(nèi)志賀菌對(duì)數(shù)期菌懸液，按照0.001 ∶1、0.01 ∶1、0.1 ∶1、1 ∶1、10 ∶1、100 ∶1 等比例加入噬菌體充分混合，靜置15 min，36 ℃培養(yǎng)15 h，按“1.2.1 噬菌體分離”介紹的方法離心過(guò)濾，采用雙層平板法，測(cè)定其最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.6 噬菌體一步式生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取對(duì)數(shù)期宋內(nèi)志賀菌，根據(jù)感染復(fù)數(shù)加入噬菌體，36 ℃培養(yǎng)15 h，11 000 r/min 離心1 min，棄上清，洗滌2 次，36 ℃預(yù)熱NB培養(yǎng)基，重懸沉淀，培養(yǎng)，測(cè)定其效價(jià)，參照杜崇濤[2]推薦的方法評(píng)價(jià)，繪制一步式生長(zhǎng)曲線，計(jì)算發(fā)生裂解的具體規(guī)模。

1.2.7 噬菌體對(duì)溫度和pH 的敏感性測(cè)定

在50 mL NB中接種一個(gè)宋內(nèi)氏志賀菌菌落，170 r/min 培養(yǎng)12 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別取0.5 mL 至50 mL 液體NA 培養(yǎng)基中，于36 ℃、170 r/min 培養(yǎng)15 h 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，標(biāo)記后各取0.3 mL 置于96 孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD600值，作為前期OD600值。

參照高苗等[3]介紹的方法對(duì)噬菌體溶液進(jìn)行如下處理：(1)取7 份1 mL 噬菌體原液，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃水浴鍋加熱30 min；(2)取7 份1 mL 噬菌體原液，加入pH范圍在4～10的30 ℃液體NA培養(yǎng)基中，在36 ℃的水中溫?zé)? min；每次取0.3 mL 測(cè)量OD600值，此處的OD600值稱為后期OD600值，前期OD600值和后期OD600值之間的差稱為OD600差。上述測(cè)試重復(fù)3 次，獲得平均值。

1.2.8 噬菌體預(yù)防試驗(yàn)

將60 羽15 日齡雛雞隨機(jī)分為3 組，每組20 羽。第1 組為空白對(duì)照組，接種生理鹽水0.3 mL；第2 組為感染對(duì)照組，接種0.3 mL效價(jià)為1.05×107CFU/mL 的宋內(nèi)志賀菌；第3 組為試驗(yàn)組，每羽雞肌內(nèi)注射0.3 mL 效價(jià)為1.05×109PFU/mL 的噬菌體；24 h 后各組用1.05×107CFU/mL 的宋內(nèi)志賀菌攻毒，每羽雞接種0.3 mL，記錄各組雛雞死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離與純化

噬菌體PG2-01 是通過(guò)雙層平板法將雞場(chǎng)污水和宋內(nèi)志賀菌共同培養(yǎng)，并選擇中間透亮的最大噬菌斑，經(jīng)反復(fù)純化獲得邊緣光滑的圓形透明噬菌斑，其直徑為1 mm～2 mm，詳細(xì)情況參見(jiàn)圖1 和圖2。

圖1 PG2-01 純化前的噬菌斑

圖2 PG2-01 純化后的噬菌斑

2.2 噬菌體的電鏡觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PG2-01 噬菌體頭部為二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約為70 nm，有一可伸縮的尾鞘(圖3)。按照國(guó)際病毒分類委員會(huì)的分類規(guī)則，PG2-01 屬于有尾噬菌體目。

圖3 PG2-01 透射電鏡觀察圖

2.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定

完成宋內(nèi)志賀菌和噬菌體混合培養(yǎng)后采用雙層平板法對(duì)其效價(jià)進(jìn)行測(cè)定(表1)，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.01 時(shí)，其效價(jià)為2.85×109PFU/mL，是6 個(gè)配比中最高的，因此0.01 是PG2-01 感染宋內(nèi)志賀菌的最佳感染復(fù)數(shù)。

2.4 繪制噬菌體PG2-01 一步生長(zhǎng)曲線

按照?qǐng)D4 顯示的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)感染過(guò)程中，PG2-01 的裂解量大約為186，潛伏時(shí)間約為20 min，暴發(fā)時(shí)長(zhǎng)大約為40 min，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.5 噬菌體PG2-01 敏感性測(cè)定

2.5.1 噬菌體PG2-01 對(duì)溫度的耐受力

溫度范圍處在30 ℃～60 ℃的菌液，OD600值的前后差值處于0 以下，即加入經(jīng)過(guò)純化的噬菌體后，PG2-01 將宋內(nèi)志賀菌裂解并造成其死亡，間接表示噬菌體在溫度為30 ℃～60 ℃的環(huán)境中活性最高，30 ℃～40 ℃的環(huán)境中菌液濃度最小，表明在30 ℃～40 ℃環(huán)境中的PG2-01 噬菌體擁有最高的自身活性以及最強(qiáng)的裂解能力。當(dāng)處理溫度達(dá)到70 ℃后菌液OD600值在后期培養(yǎng)過(guò)程中明顯升高，說(shuō)明噬菌體在溫度為70 ℃的環(huán)境中喪失自身活性(圖5)。

2.5.2 噬菌體PG2-01 對(duì)酸堿的耐受能力

pH 為5～8 時(shí)，菌 液OD600差 值都 在0 以下，這表示此時(shí)PG2-01 的殺菌能力最強(qiáng)，當(dāng)pH 為4、9 和10 時(shí)，差值回到0 以上，說(shuō)明PG2-01 的殺菌能力在該pH 范圍有所降低，pH低于4 或高于9 的環(huán)境不適合PG2-01 殺菌和繁殖(圖6)。

2.6 噬菌體PG2-01 對(duì)宋內(nèi)志賀菌感染的預(yù)防效果

由表2 可知，感染之前預(yù)防性肌內(nèi)注射噬菌體可有效預(yù)防雛雞的感染，成活率比空白對(duì)照組的提高20%，對(duì)雛雞的保護(hù)率可以達(dá)到90%，而感染對(duì)照組的成活率僅有30%，與空白對(duì)照組的相比降低了40%。

3 結(jié)論

PG2-01 噬菌體能分解殺滅宋內(nèi)志賀菌，具有生物特異性強(qiáng)、繁殖快、耐力好、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、安全有效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)雞有很強(qiáng)的保護(hù)作用，發(fā)展前景非常廣闊，具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

4 討論

志賀菌會(huì)導(dǎo)致雞發(fā)生以腹瀉為主要癥狀的傳染病。不同日齡、品種的雞都可感染志賀菌，成年雞的死亡率和發(fā)病率低于雛雞的[4]。近年來(lái)，雞志賀菌的多重耐藥性呈明顯增高的趨勢(shì)，宋內(nèi)志賀菌的感染比例也呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，因此研究無(wú)抗藥性的志賀菌噬菌體勢(shì)在必行。作者對(duì)該噬菌體的環(huán)境耐受能力進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示其耐受能力較強(qiáng)，在較寬的pH 及溫度范圍內(nèi)都表現(xiàn)出極強(qiáng)的噬菌能力。預(yù)防性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噬菌體PG2-01 對(duì)雛雞具有較高的保護(hù)率，可以有效提高雛雞的成活率。