姚慶和 黃建圍 曹東彪 陶山偉

腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病,死亡率約占所有疾病的10%,50%～70%的存活者遺留有肢體癱瘓、失語、智力障礙等嚴(yán)重殘疾。腦出血約占全部腦卒中的8%～14%,死亡率高,存活患者也往往遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。腦出血最常見的是長期高血壓導(dǎo)致的基底節(jié)區(qū)腦動脈破裂出血,腦細(xì)小動脈的硬化在發(fā)病機(jī)制中占有重要地位,但腦動脈硬化的病理機(jī)制尚不十分清楚,目前發(fā)現(xiàn)伴有免疫反應(yīng)的慢性炎癥過程在動脈硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起著決定性作用。本研究通過手術(shù)中切取高血壓基底節(jié)區(qū)腦出血患者已破裂動脈止血后的殘端,檢查Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLR)家族中TLR4 在高血壓基底節(jié)區(qū)腦出血患者破裂動脈的表達(dá),探討TLR4 在促進(jìn)腦動脈硬化形成的作用,為腦出血的防治提供新的思路?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017 年1 月～2019 年4 月收治的20例高血壓基底節(jié)區(qū)腦出血患者,其中男13例,女7 例；年齡42～68 歲,中位年齡55.4 歲；高血壓病史1～19 年,平均高血壓病史7.8 年；發(fā)病至入院時間1～6 h,平均發(fā)病至入院時間2.3 h；均經(jīng)頭顱CT 掃描檢查確診為基底節(jié)區(qū)腦出血；出血量44～86 ml,平均出血量61.6 ml；格拉斯哥昏迷量表(GCS)評分：8～12 分7 例,3～8 分13 例,平均GCS 評分6.6 分。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 采用全身麻醉,額顳部弧形切口,游離骨瓣開顱,手術(shù)顯微鏡下由顳上回皮層造瘺進(jìn)入血腫腔,緩慢吸除血腫,在基底節(jié)區(qū)血腫底部尋找破裂動脈,在破裂口近端數(shù)毫米處雙極電凝止血,切除止血后的殘端部分約2～3 mm。同時在額顳部頭皮弧形切口已切斷顳淺動脈的分支切取2～3 mm 后止血,不影響頭皮切口愈合(切除高血壓基底節(jié)區(qū)腦出血已破裂動脈止血后的血管殘端,頭皮切口中已切斷的顳淺動脈分支2～3 mm,而并非切取患者的正常腦動脈和頭皮動脈,因此對患者治療和預(yù)后無任何不利影響,此研究已經(jīng)通過醫(yī)院倫理委員會審查并獲批準(zhǔn))。切取標(biāo)本甲醛固定,石蠟包埋。術(shù)中根據(jù)腦壓情況決定是否保留顱骨骨瓣,術(shù)后給予脫水降顱壓、止血、營養(yǎng)神經(jīng)等藥物治療,病情穩(wěn)定后轉(zhuǎn)康復(fù)科行神經(jīng)功能康復(fù)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測 石蠟組織塊切片后,0.3%過氧化氫甲醇溶液［30%過氧化氫1 ml+甲醇80 ml+磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 19 ml］處理30 min,0.3%Triton X-100 的PBS 處理 30 min,然后浸入鼠抗TLR4 單克隆抗體(1∶100)孵育48 h(4℃),浸入生物素化兔抗小鼠二抗(1∶500)孵育2 h(室溫),浸入親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)(1∶500)孵育2 h(室溫),蒸餾水快速沖洗后在DAB-H2O2溶液中進(jìn)行呈色反應(yīng)20～30 min,當(dāng)陽性產(chǎn)物呈棕褐色而背底清晰時終止顯色。以上步驟每步后均需0.01 mol/L PBS 清洗3 次,10 min/次。其中一抗用含1%牛血清和0.3%的Triton X-100 的PBS 稀釋,二抗和ABC 復(fù)合物用PBS 稀釋。貼片,脫水,透明,中性樹膠封片。在5 個高倍視野(400×)計數(shù)破裂動脈與顳淺動脈壁中TLR4 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞個數(shù),取平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗；P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療結(jié)果 手術(shù)后均復(fù)查頭顱CT,腦內(nèi)血腫清除程度為76%～95%,神經(jīng)外科住院時間14～35 d,平均住院時間21.4 d,隨訪6～12 月,無死亡病例,20 例均意識恢復(fù),對側(cè)肢體肌力0～4 級,均遺留不同程度對側(cè)肢體偏癱癥狀。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 20 例患者中破裂動脈TLR4 表達(dá)呈陽性,而顳淺動脈TLR4 低表達(dá)。見圖1。

2.3 TLR4 表達(dá)陽性細(xì)胞計數(shù) 破裂動脈每400×高倍視野下TLR4 表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)為(31.35±3.08),高于顳淺動脈的(3.36±1.17),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 TLR4 免疫組織化學(xué)染色后破裂動脈與顳淺動脈的表達(dá)

圖2 每400×高倍視野下TLR4 表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)(aP<0.05)

3 討論

高血壓腦出血是臨床常見的一種嚴(yán)重腦血管疾病,其中最常見的是基底節(jié)區(qū)腦出血,占所有高血壓腦出血患者的40%～50%。腦內(nèi)小動脈本身具有不同于其他小動脈的一些組織學(xué)特點,如血管壁較薄、血管周圍無堅實的組織支持,故較其他臟器較容易發(fā)生出血。同時長期的高血壓可以造成小動脈的內(nèi)膜損傷,血漿中的某些成分通過損傷的內(nèi)膜進(jìn)入內(nèi)膜下層,引起自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的炎性反應(yīng),形成硬化、斑塊甚至玻璃樣變,這使得腦動脈內(nèi)膜的完整性受到損害,以至形成微動脈瘤或管壁壞死。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)小動脈的病理變化在腦出血的發(fā)病機(jī)制中占有十分重要的地位,其中尤以細(xì)小動脈硬化及玻璃樣變性為高血壓腦出血的首要血管病理改變［1,2］。

動脈硬化及斑塊形成是多方面因素相互作用的結(jié)果,炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)皮功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、機(jī)械力學(xué)、理化因素等多種發(fā)病機(jī)制參與動脈硬化和血管重塑的形成［3-5］。隨著近年來基礎(chǔ)研究及科研水平的不斷進(jìn)步,對腦動脈硬化形成及其發(fā)生發(fā)展規(guī)律的研究也逐漸由細(xì)胞水平深入到分子水平,發(fā)現(xiàn)在動脈硬化過程中,伴有免疫反應(yīng)的慢性炎癥過程在動脈硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起著決定性作用［5,6］。

TLR 是免疫細(xì)胞表面識別病原相關(guān)分子模式的一種模式識別家族受體,其作為一類重要的蛋白質(zhì)分子參與非特異性免疫(天然免疫)。經(jīng)過十多年的探索,已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)10 余個TLRs 家族成員,其中TLR4 與動脈粥樣硬化形成關(guān)系較為密切［7］。TLR4 主要在髓源性細(xì)胞(如單核巨噬細(xì)胞)上表達(dá),與特定的配體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)活化通路,促使相關(guān)炎性因子和Ⅰ型干擾素的基因表達(dá)。在腦組織內(nèi),腦小血管病變誘發(fā)的認(rèn)知障礙與海馬組織內(nèi)的TLR4 過表達(dá)和膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)密切相關(guān)［8,9］。近年來,國內(nèi)外越來越多的科研成果證實TLR(尤其TLR4)在動脈硬化斑塊發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,主要表現(xiàn)在慢性炎癥和免疫反應(yīng)的相互作用中起著決定性的橋梁作用［7,10］。Gibson等［11］研究揭示,TLR4 在動脈硬化病變血管內(nèi)膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)較正常血管內(nèi)膜升高,炎性因子在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用下,刺激血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞,快速增生的平滑肌細(xì)胞具有催化動脈硬化斑塊形成的作用。Michelsen 等［12］對敲除TLR4 基因小鼠研究表明,正常組小鼠的動脈硬化斑塊面積及厚度明顯高于TLR4 基因缺失小鼠,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)等因子也可使TLR4 在動脈硬化斑塊組織中的表達(dá)量增加。越來越多的證據(jù)表明,TLR4 作為免疫反應(yīng)和慢性炎癥之間聯(lián)系的橋梁,在動脈斑塊形成過程中有著復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)［13-15］。多種炎癥因子或趨化因子可能通過TLRs 信號傳導(dǎo)通路途徑造成動脈硬化,而抑制TLRs 的表達(dá)則抑制動脈硬化的發(fā)生［16］。目前研究認(rèn)為［17］,TLR4 的信號通路主要有兩條途徑：一條是髓樣分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)途徑,另一條是MyD88 非依賴途徑。最新研究表明,在實驗?zāi)X出血大鼠模型中,激活TLR4-MyD88-JNK(Jun N-terminal kinase)信號通路能夠促進(jìn)腦組織的炎性反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)組織凋亡［18］。當(dāng)胞外信號傳遞到胞內(nèi),胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域TIR 與MyD88 的羥基端結(jié)合,同時 MyD88 氨基端再與白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體相關(guān)激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4)結(jié)合,激活I(lǐng)RAK4。IRAK4 磷酸化后與MyD88 分離,進(jìn)一步和腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)受體因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)相互作用。TRAF6 激活核因子κB(NF-κB)抑制物的激酶(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinases,IKKs)復(fù)合體,誘導(dǎo)IκB (Inhibitor of nuclear factor kappa-B)磷酸化。磷酸化的IκB 從復(fù)合物中分離出來,直接靶向泛素化和蛋白酶體降解,從而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。釋放的NF-κB 位于細(xì)胞核,介導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)［19］。IKKs 的信號通路激活MAPK 級聯(lián)導(dǎo)致另一個轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(AP-1)的激活。它們都在促炎細(xì)胞因子的表達(dá)中發(fā)揮重要作用［20］。通過抑制TLR4/NF-κB 通路可以減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng),減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［21,22］。MyD88 非依賴途徑是由易位關(guān)聯(lián)膜蛋白(Translocating chain-associated membrane protein,TRAM)啟動的。依賴β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域連接蛋白(TIR domaincontaining adaptor inducing IFN-β,TRIF) 被 招募后,與IKKs 相互作用,實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子IRF3 的磷酸化［23］。TRIF 還能與IRAK1 相互作用,激活轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子7(Interferon regulatory factory 7,IRF7)。激活的IRFs 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,與DNA 結(jié)合,產(chǎn)生β 型干擾素(IFN-β)等抗病毒分子［24］。TRIF 還通過受體相互作用蛋白1(Receptor-interacting protein 1,RIP1)來激活MyD88 非依賴的NF-κB 途徑。RIP1 與TRIF結(jié)合,導(dǎo)致Fas 相關(guān)的死亡域依賴性凋亡和NF-κB激活［25］。目前TLR4 在動脈粥樣硬化疾病作用中的研究大多集中在頸動脈、冠狀動脈和周圍動脈,對腦細(xì)小動脈硬化形成的研究相對較少,許多研究主要在動物模型或者尸檢組織中進(jìn)行,缺乏直接在高血壓基底節(jié)區(qū)腦出血患者破裂動脈上TLR4 表達(dá)情況的研究及相關(guān)性的分析。

本研究在手術(shù)中直接切取高血壓基底節(jié)區(qū)腦出血患者已破裂動脈止血后的殘端,然后應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TLR4 在其的表達(dá)情況,并與同一患者頭皮切口中切開顳淺動脈分支的表達(dá)情況進(jìn)行對比,分析TLR4 與破裂動脈病理改變的相關(guān)性,直接在人類組織驗證TLR4 促進(jìn)腦動脈硬化形成的作用,結(jié)果顯示破裂動脈TLR4 較高的表達(dá),而顳淺動脈TLR4 低表達(dá),提示了TLR4 在腦細(xì)小動脈硬化形成中有一定的作用,是高血壓基底節(jié)區(qū)腦出血的部分原因,為尋找新的干預(yù)靶點提供了一定的實驗依據(jù),為高血壓腦出血的防治提供了一種思路。