劉婭 李龍浩 綜述 鄧紅彬 審校

通常機體主要通過免疫監(jiān)視、免疫識別、免疫反應等維持免疫穩(wěn)態(tài)，其中任一環(huán)節(jié)不完整將破壞免疫穩(wěn)定甚至造成免疫逃逸。免疫治療通過增強腫瘤抗原的免疫原性、APC提呈抗原能力或者解除免疫抑制，從而調節(jié)免疫通路活性或改善腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），解除機體免疫抑制狀態(tài)，產生持久的抗腫瘤免疫應答能力。目前，免疫治療以全身性的靜脈用藥為主，盡管能有效激活機體的抗腫瘤效應，但關于炎癥分子風暴、毒血癥及某些嚴重的免疫相關不良反應的報道并不少見，這些因素使得免疫治療藥物的使用濃度和劑量受限，致病灶局部血藥濃度不足，免疫活性低下，產生免疫逃逸或耐藥。因此，通過瘤內、引流淋巴結內直接給藥或者引流淋巴結附近皮下給藥的局部免疫治療被探索實踐。越來越多的證據(jù)顯示，局部免疫治療能改變TME和免疫環(huán)境，引發(fā)不同程度的全身免疫反應，具有良好的耐受性、安全性及療效［1］。目前，臨床局部免疫治療主要有局部注射細胞因子、DC疫苗、腫瘤疫苗、溶瘤病毒、單克隆抗體、免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）及某些可溶性小分子等，本文將選取正在進行的極具前景的局部免疫治療研究并對其進展進行綜述。

1 局部免疫治療的理論依據(jù)

免疫治療作為一種新型治療方式，目前主要是通過靜脈給藥，而大多免疫相關毒性與血藥濃度相關，近年來報道的免疫相關嚴重不良反應發(fā)生率也較高，這無疑限制了免疫治療的給藥劑量和周期，使病灶局部藥物濃度難以達到理想水平，導致治療效果欠佳且容易產生耐藥。另外，腫瘤具有異質性，同一機體不同部位腫瘤抗原存在差異，進展過程中也在不斷產生新抗原，同時分泌基質以抵抗藥物進入病灶局部發(fā)揮作用。因此，一種新的治療形式產生，即局部免疫治療，在針對腫瘤多克隆抗原產生特定抗體，提高免疫治療療效、減輕免疫相關不良反應、擴大免疫治療獲益人群等方面具有明顯優(yōu)勢。首先，局部免疫治療通過瘤內、淋巴結內甚至皮內直接給藥，藥物經淋巴引流到達原發(fā)灶和第三淋巴引流區(qū)（third drainage lymph nodes，TDLNs）內，不僅能以腫瘤本身作為抗原形成特異性“原位”疫苗促進腫瘤相關抗原（tumor associated antigens，TAAs）的釋放，誘導抗腫瘤T 細胞應答，產生系統(tǒng)性、持續(xù)性抗腫瘤效應，將“冷腫瘤”變成“熱腫瘤”［2］。更重要的是，能在病灶局部形成高血藥濃度，而不帶來明顯的免疫相關不良反應，減少耐藥和抵抗的產生，尤其有利于改善劑量限制性藥物的使用［3］。聯(lián)合化療、放療、ICIs等展現(xiàn)出了良好的安全性及有效性，其中局部免疫治療聯(lián)合ICIs 治療已成為極具研究前景的治療方式。相關小樣本研究結果見表1。

表1 局部免疫治療聯(lián)合ICIs的小樣本研究

2 局部免疫治療的研究進展

2.1 Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）激動劑

TLRs 是固有免疫的重要模式識別受體，通過胞外結構感知微生物、病毒產物的成分或產物，如細菌細胞壁成分或雙鏈DNA等，誘導樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）成熟和細胞因子分泌，促進先天性或適應性免疫應答。TLRs除了能表達在巨噬細胞、DC細胞等免疫細胞表面，誘導機體免疫應答，還能表達在腫瘤細胞表面，促進腫瘤生長。所以TLRs 的效應取決于機體的綜合作用，但大多數(shù)TLRs 帶來的是抗腫瘤效應［4］。TLR9 激動劑是富含C-G 的合成寡核苷酸，有B 型和C 型兩種類型。PF-3512676 屬于B 型TLR9 激動劑，主要激活B 細胞，系統(tǒng)性PF-3512676治療聯(lián)合化療出現(xiàn)了較為嚴重的不良反應，且未改善臨床結果［5］。而瘤內注射PF-3512676聯(lián)合/不聯(lián)合放療在淋巴瘤或真菌樣肉芽腫治療中被證實安全且有效［6］。SD-101 屬于C 型TLR9，能同時激活B 細胞和漿細胞樣DC細胞。一項Ⅰb期早期臨床試驗證實瘤內注射SD-101 聯(lián)合pembrolizumab 治療晚期黑色素瘤患者，能顯著提高腫瘤腫瘤客觀緩解率（objective response rate，ORR）并誘導廣泛腫瘤激活［7］。同樣，瘤內注射SD-101 聯(lián)合低劑量放療及瘤內聯(lián)合注射SD-101、CTLA-4抑制劑和OX40 mAb 等均被證實能誘發(fā)全身抗腫瘤免疫效應，根除轉移性疾病，且不良反應可耐受，對伴有軟腦膜轉移的中樞神經系統(tǒng)性淋巴瘤也是有效的［8］。早期臨床研究表明，瘤內注射TLR9激動劑聯(lián)合PD-1抑制劑能進一步增強淋巴引流區(qū)T細胞浸潤，逆轉既往PD-1耐藥，在注射與非注射部位均能產生持久的免疫效應［9］。

Imiquimod（R848）和resiquimod 均為美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準用于治療惡性黑色素瘤和鱗狀細胞癌的TLR8激動劑，通過IFNa/β介導體內免疫反應，同時還能激活Bax 蛋白促進腫瘤細胞凋亡［10］。Imiquimod 是最早使用的TLR 激動劑，有臨床試驗報道，TLRs 激動劑的全身使用會導致較嚴重的不良反應，而局部imiquimod 治療能有效控制局部皮膚黏膜黑色素瘤和乳腺癌皮膚復發(fā)，同時具有較低不良反應［11］。除了治療表淺腫瘤，近來有實驗證據(jù)表明，瘤內注入R848 治療胰腺導管腺癌同樣具有良好的抗腫瘤活性，該研究重點探索了R848 在治療伴有惡病質情況的可行性［12］。另外，有早期臨床研究表明局部Toll樣受體激動劑聯(lián)合PD-1/PD-L1阻滯劑能使PD-L1 表達上調，提示可能逆轉PD-1 治療后耐藥［13］。

2.2 DCs疫苗的局部使用

DCs 是最專業(yè)的抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs），交叉呈遞腫瘤抗原，并與特異性T細胞結合，促進TH1分化，在誘導和維持抗腫瘤反應中發(fā)揮著關鍵作用，但同時新生DCs Fc 受體的表達也可以介導對腫瘤的保護作用［14］。所以，DCs在抗腫瘤免疫治療中具有刺激和抑制雙重作用，取決于其細胞亞群和成熟狀態(tài)。尤其是CD103+DCs 亞群，是促免疫C-X-C 基序趨化因子（C-X-C motif chemokine 9，CXCL9）與CXCL10 的主要來源，其腫瘤灶內的表達、浸潤與臨床治療結果相關［15］。DC 疫苗運用較早且安全性良好，Triozzi 等［16］在20 世紀初期證實了瘤內注射DC 疫苗可誘導有效的原位抗腫瘤活性。Yamanaka 等［17］通過比較皮內注射和瘤內、皮內同時注射自制DC疫苗的有效性后得出，瘤內和皮內同時注射能為Ⅳ級膠質瘤患者帶來生存獲益。然而，Bol等［18］的臨床試驗結果卻顯示淋巴結內DC 疫苗注入療效低于系統(tǒng)性DC疫苗治療，并且不良反應不可耐受。顯然，藥物聯(lián)合方式與治療結果密切相關，也可能是結內注藥破壞了淋巴結結構。這些早期結果促進了DC細胞的臨床研究。

2.3 以溶瘤病毒為主的局部免疫治療

溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）是一類極具前景的新型抗腫瘤免疫治療藥物，由于病毒體積較大，可以根據(jù)需要編碼多種基因，導入機體后能快速復制和溶解腫瘤細胞，持續(xù)性誘導特異性抗腫瘤免疫效應。而病毒的溶解特性以及宿主的抗疫苗免疫反應將阻止不受限制（和潛在的危險）的細胞因子的產生。OVs 一方面能直接溶解、破壞腫瘤細胞，另一方面，病毒在腫瘤細胞內增殖激活體內抗病毒系統(tǒng)，腫瘤壞死崩解后釋放TAAs、損傷相關分子模式引發(fā)固有或適應性免疫反應［19］。

HF10 是一種自然突變型1 型人單純皰疹病毒（human herpes simplex virus，HSV1），是一種未經基因修飾的OV。自瘤內注射HF10 治療不可手術的胰腺癌患者被證實具有良好的安全有效性后，Hirooka等［20］設計了一項經內鏡超聲引導局部注射HF10 聯(lián)合厄洛替尼和吉西他濱治療局部晚期胰腺癌Ⅰ期臨床研究，結果顯示12 例患者的中位無進展生存期（median progression-free survival，mPFS）為6.3 個月，中位總生存（median overall survival，mOS）為15.5 個月，證實了在內鏡超聲（endoscopic ultrasonography，EUS）引導下，局部HF10聯(lián)合藥物治療胰腺癌具有良好的安全性和明顯的臨床獲益。而將HF10 改造為能表達GM-CSF 的mGM-CSF 擴增子并注入腹腔內，用于治療伴有腹腔轉移的卵巢癌小鼠模型，結果延長了小鼠OS，同時減少了腹腔播散風險［21］。目前，正在進行的有關臨床試驗包括HF10 聯(lián)合nivolumab 作為可切除黑色素瘤的新輔助治療的探索。

除了天然OVs，早在20世紀90年代，科學家們敲除腺病毒的E1B-55K基因，制成中國首個獲批的、聯(lián)合化療治療鼻咽癌的溶瘤病毒-H101。Xia等［22］報道了瘤內H101注射聯(lián)合化療對比單純化療治療頭頸部及食管鱗癌，有效率提高了1 倍，且相對安全。近年來，瘤內H101注射治療肺癌或動脈化療栓塞（TACE）聯(lián)合H101灌注治療晚期肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）均被報道可明顯延長患者的OS［23］。目前，一項H101聯(lián)合射頻消融治療HCC的臨床試驗正在進行。

Talimogene laherparepvec（T-VEC），是2015年至今FDA批準的第一個也是唯一一種可用于局部治療復發(fā)、無法切除的皮膚、皮下或淋巴結轉移的黑色素瘤，也是目前運用最廣泛的溶瘤病毒。T-VEC 源于HSV-1，病毒內阻止MHC-I 類分子表達的基因被敲除（ICP34.5與ICP47），同時植入了編碼GM-CSF的基因片段［24］。一項Ⅲ期隨機開放試驗（OPTIM）結果顯示：相對于單純皮下注射GM-CSF，瘤內T-VEC 注射有更高的持久應答率（endurance response rate，DRR）、完全緩解（complete remission，CR）（P＜0.001）和更長的mOS，這在未經治療或分期較晚患者中尤其明顯，不良反應可耐受［25］。早期臨床試驗已證實，與單一ipilimumab 治療相比，T-VEC 聯(lián)合ipilimumab更能有效提高ORR。瘤內注射T-VEC 聯(lián)合靜脈CTLA-4/PD-1 抑制劑被證實明顯增加了IFN-γ、CD8+T細胞浸潤，無論是在藥物注射或非注射部位，均觀察到較單一免疫治療更持久、有效的抗腫瘤活性，且能逆轉腫瘤對PD-1阻斷劑的原發(fā)性耐藥［26-27］。目前正在進行的有關瘤內T-VEC治療聯(lián)合ICBs或放化療包括早期乳腺癌的新輔助治療，晚期肉瘤、黑色素瘤治療等。Pexa-Vec（JX-594）是能表達GM-CSF 的Wyeth牛痘疫苗，早期臨床試驗已展現(xiàn)出Pexa-Vec 全身使用的安全有效［28］。而局部JX-594治療尚處于探索階段，一項Ⅱ期臨床試驗比較了兩個劑量水平［1×108/（Pfu）或1×109/（Pfu）］的瘤內Pexa-Vec 治療晚期HCC療效，結果顯示肝內反應率無明顯差異，但高劑量組OS 更長［29］。瘤內高劑量Pexa-Vec 治療兒童惡性腫瘤也是安全的［28］。同樣，瘤內Pexa-Vec 聯(lián)合ICIs 也能重塑TME，逆轉對ICIs 的耐藥。目前，除肝內Pexa-Vec 注射聯(lián)合sorafenibvs.單藥索拉菲尼（sorafenib）治療晚期HCC的開放、隨機Ⅲ期臨床研究（PHOCUS試驗）正在進行。

2.4 單克隆抗體、免疫檢查點抑制劑的局部應用

通常，CD8+T細胞能選擇性地被主要組織相容性抗原復合體Ⅰ類分子激活，當DC細胞處理并提呈腫瘤抗原至引流淋巴結，即能誘導機體啟動T細胞免疫反應。免疫逃逸的產生往往源于該途徑啟動的失敗或通路失活。免疫治療尤其是ICIs，通過特異性結合CTLA-4/PD-1受體，釋放“免疫剎車”，誘導產生針對腫瘤多樣性抗原的多克隆抗體，增加病灶局部甚至全身免疫活性細胞浸潤。另一方面，TME 中具有多種免疫細胞，包括髓源性抑制細胞（myeloidsuppressor cells，MDSCs）、調節(jié)性T細胞（Tregs）、腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）、輔助性和效應性細胞毒性T 細胞（Th/Teff）、DCs 以及腫瘤分泌的免疫調節(jié)因子，ICIs 抑制免疫微環(huán)境，促進腫瘤局部甚至遠處部位免疫細胞浸潤，增強機體抗腫瘤免疫活性［30］。因此，包括CD40 mAbs、ICIs 在內的單克隆抗體旨在激活免疫反應、改善TME，調節(jié)免疫應答，從而增強機體抗腫瘤活性。

CD40 是TNF 家族受體成員，廣泛表達于DC 細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞等表面，DC表面的CD40 能誘導T 細胞介導的抗腫瘤免疫反應。CD40 配體（CD154），主要表達在活化的T 細胞上，與CD40 結合后可上調細胞因子IL-12、黏附分子、共刺激分子和MHC 表達、增強APC 功能、激活T 細胞等。研究發(fā)現(xiàn)CD40的激活通路獨立于固有免疫途徑（如干擾素基因刺激因子STING 或TLRs 通路）［31］。靜脈使用CD40 mAbs 具有良好臨床療效，但可能導致嚴重的不可耐受的細胞因子釋放綜合征和肝功能異常［32］。多項臨床前試驗已表明瘤內CD40 mAbs 治療不但能減少不良反應，還具有良好療效。當CD40 mAbs 聯(lián)合TLR4 局部注射時，可恢復機體PD-1 細胞的敏感性，再聯(lián)合ICIs 后，可改善DFS［33］。放療聯(lián)合瘤內CD40激動劑治療則具有協(xié)同作用，并形成長久的免疫記憶［34］。

ICIs 包括CTLA-4、PD-1/PD-L1 抑制劑，作用于免疫細胞表面的CTLA-4或PD-1/PD-L1，系統(tǒng)性ICIs單藥或者聯(lián)合其他治療在臨床中已凸顯療效，但免疫相關不良反應與體內ICIs的濃度相關。研究表明，經腫瘤局部和靜脈予以CTLA-4阻滯劑，達到相同療效時，局部給藥方式在血清中的藥物濃度僅為全身給藥的1/8，并能激活全身免疫反應，根除遠處腫瘤，免疫相關不良反應明顯降低［35］，并提示或許能有效逆轉其他藥物或治療方式所致的免疫耐藥。一項Ⅰ期臨床試驗結果顯示，瘤內ipilimumab+IL-2 注射于晚期黑色素瘤治療中在原發(fā)灶及轉移灶中均體現(xiàn)出良好的耐受性及增強的免疫活性［36］。同樣，局部CTLA-4 阻滯劑聯(lián)合調節(jié)性Treg 細胞耗竭治療晚期惡性腫瘤被證實能誘導荷瘤小鼠的永久免疫和腫瘤的永久消退［37］。而聯(lián)合放療則能夠逆轉免疫原性差的轉移性乳腺癌小鼠對單一免疫治療的耐藥，降低轉移風險，延長生存［38］。

2.5 可溶性小分子的局部使用

絕大多數(shù)藥物或制劑都能直接參與或者誘導機體免疫反應，而PV-10（provectus biopharmaceuticals）則通過間接方式誘發(fā)有效免疫反應。PV-10是一種病灶內的注射可溶性二鈉鹽，PV-10能選擇性聚集于轉化細胞的溶酶體內并將其裂解，激活機體產生強烈的抗腫瘤免疫反應［39］。PV-10早已被FDA 批準為治療轉移性黑色素瘤及HCC 的用藥，并在多項早期局部治療及聯(lián)合放療、免疫檢查點抑制劑治療中證實安全性及耐受性好［40］。盡管一項比較PV-10、化療和溶瘤病毒在局部晚期黑色素瘤療效的Ⅲ期臨床試驗因入組人數(shù)不足而提前終止，但另一項PV-10 聯(lián)合化療治療肝癌的Ⅰ期臨床試驗正在展開。

3 局部免疫治療聯(lián)合其他治療

3.1 聯(lián)合放療

放療主要用于早期腫瘤的輔助治療以及晚期無法根治腫瘤的姑息減癥治療，一方面通過電離輻射直接或間接作用消滅腫瘤，另一方面，破壞的腫瘤細胞可釋放自身抗原，形成原位腫瘤疫苗，使“冷腫瘤”轉化為“熱腫瘤”，誘發(fā)局部甚至全身免疫反應。然而，放療本身具有建立與破壞免疫反應的雙重作用，放療的最終效應取決于輻射總劑量、排序、單次劑量及分割方案。此外，某些體積較大的腫瘤對放療具有抵抗性。證據(jù)表明，放療聯(lián)合全身免疫治療能增加TAAs數(shù)量、增強APCs交叉提呈抗原能力和T細胞激活，誘導趨化因子CXC 模體CXCL9、CXCL10、CXCL11 表達等，促進T 細胞向腫瘤灶及引流淋巴結遷移，逆轉TME 的免疫抑制，控制局部腫瘤生長，同時也能清除遠處轉移部位腫瘤，即遠隔效應［41］，但這種聯(lián)合治療方式導致嚴重不良反應的案例并不少見。臨床前實驗或早期臨床試驗數(shù)據(jù)均顯示，放療聯(lián)合局部免疫治療打破了全身治療帶來的劑量限制性毒性，同時改善生存［42］。盡管這樣，真實世界中能從免疫治療獲益的人群僅為少數(shù)，那么，如何篩選合適的患者，如何將不同的免疫治療方式與放療相結合，以及如何根據(jù)患者自身動態(tài)變化選擇并調整最佳的放療及免疫治療的時機、劑量和靶區(qū)，最大限度地提高放療與免疫治療的協(xié)同作用成為焦點問題。近來，Grassberger等［43］結合現(xiàn)有臨床數(shù)據(jù)，開發(fā)了一種預測免疫治療和放療相互作用的建模方法，并強調其如何與抗腫瘤免疫的生物標記物相結合來優(yōu)化放療方案，尚待大規(guī)模實驗數(shù)據(jù)進一步驗證。

3.2 聯(lián)合光治療

光治療主要是指光動力治療（photodynamics therapy，PDT）和 光 熱 治 療（photothermal therapy，PTT）。PDT 涉及可見光及光敏感劑，可見光激活光敏劑后，誘導產生活性氧，從而利用光毒性將腫瘤細胞毀滅。PTT則是在光激發(fā)下，利用光熱劑將光能轉化為熱能，誘導癌細胞的熱消融。PDT和PTT均顯示出具有選擇性的局部治療優(yōu)勢，不對周圍組織造成破壞，因此成為臨床上代替放化療及手術治療SCC的不二選擇。但由于光線穿透性差或局部光毒性不足，單一方式治療腫瘤復發(fā)率高。兩者聯(lián)合治療可提高治療療效［44］。原位光免疫治療（in situphotoimmunotherapy，ISPI）是結合局部選擇性PTT 和免疫佐劑的免疫療法，光熱療法使病灶局部溫度升高、釋放DAMPs 及腫瘤相關抗原、誘導熱休克蛋白和腫瘤細胞破壞，產生殺傷腫瘤和刺激抗腫瘤免疫反應的協(xié)同作用。激光免疫治療屬于ISPI 之一，在鱗狀細胞癌、乳腺癌、黑色素瘤的治療中展現(xiàn)出治療潛力［45］。

4 結語

隨著對腫瘤發(fā)生及免疫治療耐藥機制的了解，精準治療已成為腫瘤治療的終極目標。人體免疫系統(tǒng)錯綜復雜，參與激活、調節(jié)、應答的免疫通路更是數(shù)不勝數(shù)，關鍵環(huán)節(jié)是免疫系統(tǒng)的正常激活，而多種相互依賴的免疫刺激途徑的聯(lián)合治療可能更具希望。全身免疫治療確實取得了優(yōu)良的療效，相比而言，局部免疫治療在無需全身暴露的情況下盡量形成病灶局部集中的免疫調節(jié)，減少了不良反應而不影響臨床療效。更重要的是，通過局部免疫調節(jié)誘導全身效應，根除播散性疾病，并產生永久性免疫記憶。盡管局部免疫治療大多仍處于實驗性探索階段，在臨床轉化中也面臨不少問題。1）動物模型（大多是小鼠模型）與人體存在巨大差異，特別是免疫調劑方面，實驗轉化為實踐可能出現(xiàn)相差甚大甚至相反的結果。2）局部免疫治療的用藥劑量、用藥方案的確定仍需更多、更大規(guī)模的研究，特別是在聯(lián)合治療方面，聯(lián)合治療的最佳獲益模式有待進一步探索。目前已有相關試驗在探索局部免疫治療在早期腫瘤新輔助治療中的地位，但需要更多更有力的證據(jù)。3）局部免疫治療對于表淺腫瘤的治療和觀察相對容易實現(xiàn)，深部腫瘤甚至內臟的治療需借助影像學工具、生物材料甚至基因工具等，或許需進一步優(yōu)化設計才可能實現(xiàn)成功轉化。但是，從現(xiàn)有的臨床結果推測，局部免疫治療是值得探索的實現(xiàn)精準治療新途徑。