劉 濤，顧家鐳，劉國(guó)坤，田中群

(1.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361102)

化學(xué)戰(zhàn)劑是一類劇毒化學(xué)物質(zhì)，在戰(zhàn)爭(zhēng)時(shí)期常被用作化學(xué)武器對(duì)敵方人員進(jìn)行大規(guī)模殺傷，由其引發(fā)的各類恐怖襲擊事件也時(shí)有發(fā)生。化學(xué)戰(zhàn)劑的種類眾多，芥子氣作為一種糜爛性化學(xué)戰(zhàn)劑分子，其毒性極強(qiáng)，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定持久，會(huì)對(duì)人的呼吸道、皮膚造成長(zhǎng)期損傷[1-2]?；诮孀託鈳淼目植劳{，實(shí)現(xiàn)該物質(zhì)的靈敏、穩(wěn)定現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前，針對(duì)芥子氣等化學(xué)戰(zhàn)劑的快速檢測(cè)技術(shù)主要有比色法、聲表面波傳感法、離子遷移譜法等。其中聲表面波和離子遷移技術(shù)發(fā)展較為成熟，已經(jīng)在實(shí)際快檢中得到了應(yīng)用。但這些方法只能進(jìn)行初步的定性分析，缺乏高選擇性，往往會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的誤判。表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)具有分子指紋圖譜的高分辨率和近單分子水平的檢測(cè)靈敏度兩大優(yōu)勢(shì)，已成為表面科學(xué)和生命科學(xué)等前沿基礎(chǔ)研究中的重要科研工具[3-5]。近年來，隨著便攜式乃至掌上型拉曼光譜儀的問世，SERS技術(shù)已被廣泛用于食品安全和公共安全等實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域，有望成為一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法[6-7]。

基于SERS技術(shù)的芥子氣檢測(cè)方法已有相關(guān)報(bào)道：Van Duyne小組[8]利用納米球光刻技術(shù)制備了一種沉積Ag膜的SERS基底，并在便攜拉曼光譜儀上對(duì)芥子氣模擬劑2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)進(jìn)行了SERS檢測(cè)；謝劍煒等[9]基于有孔Au@SiO2核殼型納米粒子，在溶膠體系中建立了一種針對(duì)芥子氣及其相關(guān)產(chǎn)物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)分析方法。目前，SERS技術(shù)檢測(cè)痕量化學(xué)戰(zhàn)劑類分子的主要策略可分為兩種。一種從提高分子有效檢測(cè)濃度角度考慮：發(fā)展前處理方法，對(duì)待測(cè)物進(jìn)行有效分離和濃縮富集。另一種則是通過提高SERS增強(qiáng)的靈敏度和選擇性：(1)制備具有高電磁場(chǎng)增強(qiáng)能力的固態(tài)SERS基底，或在溶膠體系中加入各類酸堿鹽形成具有豐富SERS熱點(diǎn)的納米聚集體；(2)通過SERS基底的表面化學(xué)修飾方法誘導(dǎo)待測(cè)分子靠近熱點(diǎn)[10-13]?？紤]到實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要，復(fù)雜的樣品前處理已無法滿足快速檢測(cè)要求，而SERS基底表面的化學(xué)改性往往針對(duì)具有特定結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)的某類分子，雖提高了特定目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度，但同時(shí)也降低了普適性，無法滿足復(fù)雜多變的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。

因此，本文從如何借助簡(jiǎn)單的靜電相互作用提高目標(biāo)分子在SERS基底的吸附能力這一關(guān)鍵因素出發(fā)，以芥子氣模擬劑2-CEES為探針分子開展相關(guān)SERS檢測(cè)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

納米溶膠消光光譜的采集于日本島津公司生產(chǎn)的UV-2550紫外-可見光譜儀上完成；納米溶膠的形貌和粒徑分布則通過SEM(日本日立公司生產(chǎn)的S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡)表征獲得；分別以高分辨拉曼成像光譜儀RAMAN-11(日本Nanophoton公司)和i-Raman plus便攜拉曼光譜儀(美國(guó)必達(dá)泰克公司)作為大型和便攜式拉曼光譜儀代表進(jìn)行SERS檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)所用各類試劑均為分析純及以上。2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)和鹽酸羥胺均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,2-CEES分子質(zhì)量為124.63，密度1.07 g/cm3；NaBr、NaF、NaCl、NaI、KCl、MgSO4以及檸檬酸鈉、氯金酸均購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。溶液配制和用水均采用法國(guó)Millpore公司生產(chǎn)的Milli-Q純水儀提供的超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 金納米粒子(Au NPs)的制備

1.2.1 15 nm Au NPs的制備取31.6 mL水置于100 mL圓底燒瓶中，加入390 μL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯金酸溶液，劇烈攪拌下加熱至沸。5 min后，迅速加入1 280 μL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的檸檬酸鈉溶液。0.5 h后，溶液由透明逐漸轉(zhuǎn)黑并緩慢變紅，最終得到亮酒紅色的Au NPs溶膠溶液。

1.2.2 50 nm Au NPs的制備將35 mL水、2 mL 1%檸檬酸鈉溶液、500 μL 0.1 mol/L 鹽酸羥胺溶液以及2.5 mL 15 nm Au NPs溶膠混合均勻后，在劇烈攪拌下緩慢滴加15 mL 0.042% 的氯金酸溶液(15 mL/h)，待反應(yīng)完全后制得(50±5) nm的Au NPs。最后，將該金納米溶膠在4 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min除去溶液中過多的檸檬酸鈉，并加入等量超純水，于低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 2-CEES標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取93.4 μL 2-CEES溶解在100 mL純水中得到1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，完全混合搖勻后用超純水逐級(jí)稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，低溫密封保存。

1.4 消光光譜及SERS光譜的獲得

取2 mL Au NPs溶膠加入潔凈石英比色皿中，加入1 mL超純水稀釋后于紫外-可見光譜儀上進(jìn)行測(cè)試。

取1.5 mL 50 nm Au NPs溶膠離心(轉(zhuǎn)速4 500 r/min)10 min，去除上清液并于96孔板中定容至150 μL，依次加入50 μL待測(cè)物溶液和50 μL無機(jī)鹽團(tuán)聚劑，混合均勻后立即進(jìn)行SERS檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au NPs的均勻性、穩(wěn)定性及重復(fù)性

由50 nm Au NPs的消光光譜(圖1A)可知，該NPs的局域表面等離激元共振(LSPR)峰位位于529 nm，半峰寬約為50 nm。與傳統(tǒng)一步法[14]得到的相似粒徑Au NPs相比，本工作得到的Au NPs的半峰寬明顯變窄，說明粒徑分布均一性更佳。SEM圖(圖1B)顯示所制備的Au NPs呈現(xiàn)近球形，表面分布一些不規(guī)則晶面；與之相應(yīng)的粒徑分布統(tǒng)計(jì)柱狀圖(插圖)表明Au NPs的平均粒徑為(50±5) nm。

圖1 Au NPs的消光光譜圖(A)及SEM圖(B)Fig.1 Extinction spectrum(A) and SEM image(B) of Au NPs colloid insert：the related size distribution histogram

SERS檢測(cè)的穩(wěn)定性和重復(fù)性是實(shí)現(xiàn)其實(shí)際應(yīng)用的必要環(huán)節(jié)，這兩個(gè)參數(shù)主要依賴于SERS增強(qiáng)基底的穩(wěn)定性和批間重復(fù)性。本研究首先測(cè)試了同一批次Au NPs的消光光譜圖，通過分析不同存儲(chǔ)時(shí)間點(diǎn)下各批次LSPR吸收峰位置的變化判斷Au NPs的穩(wěn)定性，并根據(jù)不同批次Au NPs的消光光譜圖，統(tǒng)計(jì)了各批次LSPR吸收峰的位置。

圖2A為3個(gè)月存儲(chǔ)期內(nèi)，4 ℃低溫條件下密封保存的Au NPs的消光光譜圖。由圖可知，存儲(chǔ)期內(nèi)，Au NPs的LSPR吸收峰位置僅在528～530 nm范圍內(nèi)波動(dòng)(圖2A插圖)，其光學(xué)性能穩(wěn)定性主要是來自于Au NPs表面吸附的負(fù)電性檸檬酸根及其氧化產(chǎn)物的保護(hù)作用(Zeta電位?-30 mV)。該結(jié)果表明3個(gè)月內(nèi)，Au NPs的穩(wěn)定性良好。進(jìn)一步考察了9個(gè)批次Au NPs的消光光譜圖(圖2B)，根據(jù)圖2B插圖可知，LSPR吸收峰均處于528～530 nm范圍內(nèi)，峰位置的波動(dòng)范圍僅為±1 nm，表明Au NPs的批次間重現(xiàn)性良好。良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性為SERS檢測(cè)及潛在實(shí)際應(yīng)用奠定了可行性基礎(chǔ)。

圖2 Au NPs隨保存時(shí)間(A)和批次(B)變化的消光光譜圖Fig.2 Storage time(A) and parallel preparation batch(B) dependent extinction spectra of Au NPs colloidinsert：the corresponding fluctuated SPR peak position

2.2 模擬劑2-CEES的常規(guī)拉曼測(cè)試及譜峰指認(rèn)

與兩端都是氯乙基的芥子氣相比，一端是氯乙基一端是乙基的2-CEES(分子結(jié)構(gòu)式如圖3插圖所示)保留了芥子氣基本的化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)其生理毒性顯著降低，因此常作為芥子氣模擬劑進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)研究。圖3為532 nm激光激發(fā)下2-CEES的常規(guī)拉曼光譜，可明顯觀察到位于653、699、753 cm-1處的特征峰。其中653 cm-1處的峰來自于C—S—C的拉伸振動(dòng)模式，699、753 cm-1處的峰則分別對(duì)應(yīng)于C—Cl的對(duì)稱和非對(duì)稱拉伸模式，同時(shí)包含C—S—C和C—H拉伸振動(dòng)模式。975、1 038、1 054 cm-1處的峰來自于C—C的拉伸振動(dòng)模式，1 290 cm-1處為C—H的彎曲振動(dòng)模式。其中，位于600～800 cm-1區(qū)間的3個(gè)拉曼特征峰被視為芥子氣及其模擬劑的特征指紋譜峰，常被用于芥子氣及其模擬劑的定性識(shí)別[15-16]。

圖3 2-CEES液體的常規(guī)拉曼光譜Fig.3 Normal Raman spectra of 2-CEES liquid

2.3 模擬劑2-CEES的水解過程

在水溶液中，芥子氣及其模擬劑分子2-CEES不穩(wěn)定，很容易發(fā)生水解。如圖4A所示，含孤對(duì)電子的硫原子首先與氯原子發(fā)生分子內(nèi)親核取代反應(yīng)生成帶正電的硫離子中間體，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步水解成乙基，2-羥基乙基硫醚[17]。其中，硫離子具有強(qiáng)親電性，極易與生物大分子中強(qiáng)親核性的富電子原子發(fā)生反應(yīng)，共價(jià)結(jié)合形成不可逆的烴化產(chǎn)物，該過程正是芥子氣分子的毒理學(xué)生理機(jī)制。

當(dāng)將新鮮制備的150 μL微量(>10 mg/L)的2-CEES水溶液與50 μL Au NPs溶液混合時(shí)，Au NPs顏色迅速由酒紅色變?yōu)楹谏f明Au NPs發(fā)生了明顯的團(tuán)聚，如圖4B插圖所示。該現(xiàn)象表明模擬劑在水中的水解速度較快，其中間體(正電性硫離子)通過形成Au—S鍵強(qiáng)吸附于負(fù)電性的Au NPs表面[18]，微量濃度水平的2-CEES即可破壞Au NPs溶膠的穩(wěn)定界面雙電層，誘導(dǎo)其團(tuán)聚形成SERS熱點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)2-CEES的檢測(cè)。從圖4B可觀察到位于615、636、1 050 cm-1處的2-CEES特征拉曼譜峰。

圖4 2-CEES的水解過程和中間產(chǎn)物(A)及10 mg/L 2-CEES與Au NPs溶膠混合前后的SERS譜圖及其團(tuán)聚狀態(tài)照片(插圖)(B)Fig.4 Hydrolysis of 2-CEES and the corresponding intermediates at different stages(A)and SERS spectra obtained before and after the addition of 2-CEES into Au NPs colloid(B)insert：the corresponding aggregation states

為了獲得更高的檢測(cè)靈敏度，實(shí)現(xiàn)從微量到痕量2-CEES的高靈敏檢測(cè)，考察了無機(jī)鹽團(tuán)聚劑對(duì)提高2-CEES檢測(cè)靈敏度的作用。

2.4 模擬劑2-CEES的SERS檢測(cè)

由前期研究可知，在溶膠體系中，無機(jī)鹽常作為團(tuán)聚劑破壞膠體雙電層，使膠體團(tuán)聚，從而構(gòu)筑SERS熱點(diǎn)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的痕量檢測(cè)。目標(biāo)分子和團(tuán)聚劑(無機(jī)鹽)的陰、陽離子在SERS基底表面的競(jìng)爭(zhēng)和共吸附行為決定了該分子能否被高靈敏檢出[19]。

圖5 10 μg/L 2-CEES的SERS譜圖隨團(tuán)聚劑種類(A)和NaBr濃度(B)的變化趨勢(shì)，以及以0.3 mol/L NaBr為團(tuán)聚劑時(shí)SERS譜圖對(duì)2-CEES濃度的依賴性(C)Fig.5 The agglomerating agents(A) and NaBr concentration(B) dependent SERS spectra of 10 μg/L 2-CEES,and 2-CEES concentration dependent SERS spectra with 0.3 mol/L NaBr as agglomerating agent(C)

擇優(yōu)選擇NaBr作為團(tuán)聚劑，考察了2-CEES的SERS譜圖隨NaBr濃度的變化情況，結(jié)果如圖5B所示。位于610 cm-1的2-CEES拉曼特征峰強(qiáng)度并未出現(xiàn)明顯變化，說明在0.3～3.0 mol/L濃度范圍內(nèi)，Br-與2-CEES在Au NPs表面的競(jìng)爭(zhēng)共吸附行為未發(fā)生顯著變化，因此選用0.3 mol/L NaBr作為團(tuán)聚劑。以Au NPs溶膠為SERS基底，其SERS譜圖隨2-CEES質(zhì)量濃度的變化如圖5C所示。參考空白對(duì)比610 cm-1附近的特征峰強(qiáng)度可知，該條件下，2-CEES的最低可檢出質(zhì)量濃度為10 μg/L水平。

考慮到化學(xué)戰(zhàn)劑現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的實(shí)際情況和需求，基于上述工作，本研究在便攜式拉曼光譜儀上進(jìn)行相關(guān)測(cè)試。如圖6A所示，對(duì)照金溶膠空白信號(hào)譜圖，在2-CEES 為0.1 mg/L時(shí)，610 cm-1附近的拉曼特征峰陡增，0.01、0.001 mg/L條件下可以觀察到640 cm-1處微弱拉曼峰的產(chǎn)生；1 000 mg/L時(shí) 610 cm-1處的峰強(qiáng)度減弱且640 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)拉曼峰；在此過程中，位于1 050 cm-1處譜峰的強(qiáng)度隨2-CEES濃度的增加而不斷增強(qiáng)。以位于1 050 cm-1處的特征SERS譜峰為例，考察2-CEES的SERS譜峰強(qiáng)度隨質(zhì)量濃度的變化關(guān)系，所得結(jié)果如圖6B所示。由圖可知，1 050 cm-1處拉曼峰強(qiáng)度隨2-CEES濃度的升高先增強(qiáng)后趨于平緩。采用Langmuir 方程對(duì)該趨勢(shì)進(jìn)行擬合，獲得r2=0.997的良好效果，說明：(1)峰強(qiáng)隨濃度的變化符合Langmuir吸附等溫模型；(2)所研究濃度范圍內(nèi)，2-CEES可能直接吸附于表面且未達(dá)到滿單層。位于610 、640 cm-1的兩個(gè)SERS譜峰的先后出現(xiàn)和拉曼峰相對(duì)峰強(qiáng)的變化可能意味著在Au NPs表面存在兩種不同吸附構(gòu)型的2-CEES分子，具體尚有待于更深入的理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)分析。

圖6 采用便攜式拉曼光譜儀，2-CEES濃度調(diào)控下的SERS譜圖(A)和1 050 cm-1處的歸一化拉曼峰強(qiáng)度的變化趨勢(shì)(B)Fig.6 Facilitated by a portable Raman spectrometer, the 2-CEES concentration dependent SERS spectra (A)and normalized Raman intensities of the 1 050 cm-1 peak(B)

對(duì)比圖5C和圖6A可知：便攜式拉曼和大型拉曼上得到的2-CEES的SERS譜圖和靈敏度基本一致，均在610 cm-1附近和1 050 cm-1出現(xiàn)了該分子的特征SERS峰；可穩(wěn)定獲得10 μg/L水平的檢出濃度。該對(duì)比充分展示了SERS技術(shù)有望成為一種可對(duì)芥子氣進(jìn)行高靈敏準(zhǔn)確定性和半定量分析的現(xiàn)場(chǎng)分析手段。

3 結(jié) 論

本文制備了尺寸均勻、重復(fù)性佳和穩(wěn)定性好的50 nm球形金納米粒子溶膠，以其為SERS增強(qiáng)基底，實(shí)現(xiàn)了對(duì)化學(xué)戰(zhàn)劑芥子氣模擬劑分子2-CEES的定性和半定量分析，獲得了μg/L級(jí)別的高靈敏準(zhǔn)確定性檢出。本工作驗(yàn)證了SERS技術(shù)用于芥子氣模擬劑快檢的可行性，為軍事上化學(xué)武器類毒劑分子的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了一種可靠的參考途徑。