李彤彤，孫曉紅，張彥瑾，趙 瑾，聶志勇*

(1.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300350；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所 抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3.軍事醫(yī)學(xué)研究院科研計(jì)劃處，北京 100850)

重金屬主要指鉛、鎘等密度大于4.5 g·cm-3的金屬[1]。隨著科技和工業(yè)的迅速發(fā)展，重金屬得到更廣泛的開采、開發(fā)和利用，由于前期過(guò)度開發(fā)及治理不到位，造成了較多的水源、土壤污染問(wèn)題；同時(shí)由于重金屬生物蓄積性強(qiáng)，將持續(xù)對(duì)生物鏈和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重威脅。另外，由于某些重金屬離子無(wú)色無(wú)味、毒性大，亦成為投毒、中毒的重要恐怖物質(zhì)[2]，如1994年清華大學(xué)才女朱令鉈中毒事件[3-4]、2010年廣東北江鉈重大環(huán)境污染事件[5]等。所以，重金屬的檢測(cè)鑒定在環(huán)境安全、反恐等方面具有重要意義。

基于人們生活、環(huán)境安全的考慮及重金屬離子的毒性差異，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生活飲用水、工業(yè)排放廢水中重金屬的含量，而國(guó)家推薦性標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法主要是依靠大型儀器在實(shí)驗(yàn)室中完成。隨著對(duì)環(huán)境問(wèn)題的日益重視以及毒劑毒物檢測(cè)防控的需求[6-7]，除火焰光度、離子遷移譜儀等實(shí)時(shí)快檢裝備外[8]，包括可見(jiàn)[9]、紫外[10-11]、熒光[12]等試劑盒、試紙條檢測(cè)技術(shù)亦得到廣泛開發(fā)和利用。其中，指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)為設(shè)計(jì)、篩選具有重金屬離子選擇性捕獲能力的核酸適配體提供了重要的理論基礎(chǔ)[13-15]，科研工作者已設(shè)計(jì)篩選出針對(duì)Ag+[16]、Hg2+[17-19]、Pb2+[20-22]、Cd2+[23]、K+[24]、Tl+[25]等在內(nèi)的多種適配體(如表1)，這些適配體可與目標(biāo)離子形成穩(wěn)定復(fù)合物并折疊成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)揮識(shí)別功能，也可以依賴重金屬離子發(fā)揮核酶(脫氧核酶)作用。由于這些金屬離子與堿基的高特異性作用，基于該原理設(shè)計(jì)的檢測(cè)體系可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)離子對(duì)其他金屬離子的出色選擇性。而這些適配體與熒光物質(zhì)結(jié)合，又可使重金屬離子與適配體的相互作用轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，這為核酸適配體-熒光傳感器的開發(fā)提供了廣闊的思路和設(shè)計(jì)空間。另外，在這些體系中使用納米材料可有效提高其性能。本文對(duì)近年來(lái)核酸適配體在重金屬離子熒光傳感器設(shè)計(jì)上的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，重點(diǎn)介紹了標(biāo)記型、非標(biāo)記型及納米材料輔助等類型。

表1 重金屬及其核酸適配體Table 1 Heavy metals and nucleic acid aptamers

1 標(biāo)記型適配體-熒光傳感技術(shù)

在標(biāo)記型適配體-熒光傳感器中，標(biāo)記后的核酸適配體具有靶標(biāo)識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)換輸出兩方面功能。待測(cè)物通過(guò)誘導(dǎo)適配體構(gòu)象發(fā)生變化，使標(biāo)記的熒光團(tuán)空間位置發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而將待測(cè)物質(zhì)信息轉(zhuǎn)換輸出為熒光信號(hào)。標(biāo)記型適配體-熒光傳感策略又可分為單標(biāo)記熒光團(tuán)電子轉(zhuǎn)移猝滅原理、雙標(biāo)記熒光團(tuán)間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理以及依賴重金屬的核酶(脫氧核酶)切割釋放熒光團(tuán)原理。

1.1 單標(biāo)記熒光團(tuán)電子轉(zhuǎn)移猝滅型

單標(biāo)記指將單一熒光團(tuán)修飾在核酸適配體一端作為信號(hào)元件。利用該熒光團(tuán)信號(hào)的增強(qiáng)或減弱來(lái)指示體系中目標(biāo)物的濃度。該類熒光探針制備相對(duì)簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性良好。目前，常見(jiàn)的單標(biāo)記適配體-熒光傳感器主要為“Turn off”模式，依據(jù)其原理可分為兩類：一是利用重金屬離子的直接誘導(dǎo)猝滅作用；二是利用設(shè)計(jì)的核酸適配體部分堿基片段的熒光猝滅特性，以重復(fù)鳥嘌呤片段及誘導(dǎo)后產(chǎn)生的G-四鏈體應(yīng)用最為廣泛。

重金屬離子的直接誘導(dǎo)猝滅作用，一般指重金屬離子通過(guò)與核酸鏈的相互作用進(jìn)而導(dǎo)致標(biāo)記熒光團(tuán)的熒光猝滅。相比于傳統(tǒng)熒光傳感器，直接利用重金屬離子猝滅游離在體系中的熒光染料，重金屬離子通過(guò)親和吸引帶負(fù)電的核酸鏈[26]，導(dǎo)致熒光團(tuán)與金屬離子之間的距離縮短，從而發(fā)生熒光猝滅，其具有背景信號(hào)低、猝滅效率高等優(yōu)點(diǎn)，且金屬離子與核酸鏈之間的親和力不依賴高特異性的核酸適配體，合成成本低。Li等[27]合成共軛芴通過(guò)酰胺鍵連接到核酸適配體上作為信號(hào)元件，無(wú)需標(biāo)記猝滅基團(tuán)構(gòu)建單標(biāo)記核酸熒光探針，利用核酸鏈和重金屬間的親和作用以及重金屬離子的直接誘導(dǎo)猝滅作用，實(shí)現(xiàn)了Pb2+的高靈敏度和高選擇性檢測(cè)。該類傳感器大多依靠結(jié)合親和力或熱力學(xué)識(shí)別目標(biāo)金屬。Li等[28]發(fā)現(xiàn)不同金屬離子與單標(biāo)記核酸鏈的結(jié)合動(dòng)力學(xué)存在差異性，首次根據(jù)其結(jié)合動(dòng)力學(xué)特征來(lái)區(qū)分金屬離子，將一端標(biāo)記羧基熒光素(FAM)的隨機(jī)核酸鏈作為熒光探針，利用Cr3+的熒光猝滅動(dòng)力學(xué)特性實(shí)現(xiàn)了湖水中Cr3+的檢測(cè)。該方法為金屬檢測(cè)和傳感器開發(fā)提供了另一個(gè)維度。

適配體上部分片段誘導(dǎo)熒光猝滅作用，主要是在核酸適配體上人為修飾具有猝滅特性的一段堿基片段，將該片段作為熒光信號(hào)猝滅元件,當(dāng)與熒光團(tuán)在合適的距離時(shí)，熒光團(tuán)和堿基之間發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(Photoinduced electron transfer，PIET)，使得熒光團(tuán)的熒光被猝滅。其中依靠鳥嘌呤堆積的自身猝滅能力構(gòu)建的單標(biāo)記適配體-熒光傳感器應(yīng)用最為廣泛。該策略的識(shí)別探針需包含兩段序列，一段為富含G的序列，一段為重金屬離子的特異性適配體序列；遠(yuǎn)離富G序列的一端標(biāo)記熒光團(tuán)，作為信號(hào)元件，富G序列作為熒光信號(hào)猝滅元件。Zhu等[23]利用特異性核酸適配體在Cd2+存在時(shí)可從無(wú)規(guī)卷曲狀態(tài)變?yōu)榍o-環(huán)結(jié)構(gòu)，拉近熒光團(tuán)和富G序列的距離，由于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光猝滅。熒光響應(yīng)與Cd2+的濃度成正比。Yang等[29]利用核酸適配體選擇性捕獲Hg2+，形成雙鏈結(jié)構(gòu)可拉近熒光團(tuán)和富G序列的距離，實(shí)現(xiàn)4.0 nmol/L Hg2+的檢測(cè)。Bian等[30]則借助Ag+可誘導(dǎo)適配體形成C-Ag+-C雙鏈結(jié)構(gòu)和富G序列的熒光猝滅性能，實(shí)現(xiàn)水樣、藥物和食品中Ag+的檢測(cè)。Zhang等[31]利用該原理設(shè)計(jì)了同時(shí)檢測(cè)Pb2+和Ag+的六氯熒光素(HEX)單標(biāo)記熒光探針，對(duì)于Pb2+和Ag+的檢出限分別為96、21 pmol/L。該體系不僅可選擇性地單獨(dú)檢測(cè)Pb2+或Ag+，而且可檢測(cè)其混合物。高密度鳥嘌呤堆疊的G-四鏈體的熒光猝滅能力強(qiáng)于單一鳥嘌呤，Wang等[32]利用該差異性實(shí)現(xiàn)了0.4 nmol/L Pb2+的檢測(cè)，以單標(biāo)記羧基熒光素(FAM)莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為識(shí)別探針，莖部3′端的3個(gè)重復(fù)鳥嘌呤片段作為熒光猝滅劑，探針環(huán)部序列T30695(GGGTGGGTGGGTGGGT)可與Pb2+形成G-四鏈體；體系中不存在Pb2+時(shí)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)使鳥嘌呤接近染料而發(fā)生PIET，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。而體系中存在Pb2+時(shí)，環(huán)部序列折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，熒光團(tuán)在G-四鏈體上有效堆積，熒光被顯著猝滅。

單標(biāo)記適配體-熒光傳感器無(wú)需進(jìn)行熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的雙重標(biāo)記，有效降低了設(shè)計(jì)及合成的難度及檢測(cè)成本。同時(shí)，該方法簡(jiǎn)單快速，在檢測(cè)重金屬離子中具有廣闊的潛力。但現(xiàn)階段仍存在一些問(wèn)題，如在熒光染料方面，部分標(biāo)記型熒光物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)存在局限，只能在特定堿基上進(jìn)行。還有部分具有優(yōu)良發(fā)光、猝滅熒光性質(zhì)的熒光物質(zhì)的標(biāo)記技術(shù)尚不成熟，限制了其應(yīng)用[33]。此外在核酸適配體一端人為修飾一段序列，易影響適配體與靶標(biāo)之間的親和力，進(jìn)而干擾檢測(cè)的選擇性。因此需要針對(duì)熒光物質(zhì)、熒光傳感策略、性能優(yōu)化等方面進(jìn)一步探索，開發(fā)、合成性能更佳的熒光物質(zhì)，并設(shè)計(jì)優(yōu)化核酸適配體鏈，以提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性。

1.2 雙標(biāo)記熒光團(tuán)熒光共振能量轉(zhuǎn)移型

單標(biāo)記傳感中，單一熒光團(tuán)的光譜行為簡(jiǎn)單，使得單標(biāo)記熒光傳感體系在復(fù)雜體系中的應(yīng)用受到了限制。近年來(lái)，雙標(biāo)記熒光傳感體系得到了科學(xué)家們的青睞。傳統(tǒng)的雙標(biāo)記核酸熒光傳感器由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)、性能以及良好選擇性被廣泛應(yīng)用。核酸分子兩端標(biāo)記基團(tuán)分別充當(dāng)熒光能量的供體和受體，當(dāng)熒光供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有部分重疊，且這兩個(gè)基團(tuán)之間距離在1～10 nm時(shí)，供體基團(tuán)被激發(fā)后可通過(guò)耦合作用將其能量傳遞給受體基團(tuán)，導(dǎo)致供體熒光猝滅，受體發(fā)射熒光，從而完成熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移的程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)[34]。Ono等[19]利用汞的核酸適配體與Hg2+形成雙鏈結(jié)構(gòu)拉近兩端熒光團(tuán)的距離，引起FRET，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢測(cè)。除了通過(guò)雙鏈結(jié)構(gòu)改變空間距離外，還可通過(guò)適配體被誘導(dǎo)折疊成的其他結(jié)構(gòu)—G-四鏈體來(lái)引起FRET。Hoang等[25]篩選出對(duì)Tl+具有較高選擇性的核酸探針(PS2.M，5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3′)，在兩端分別修飾羅丹明(TMR)和FAM(如圖1)，Tl+誘導(dǎo)PS2.M折疊成G-四鏈體，引起518 nm處FAM的發(fā)射峰強(qiáng)度下降，585 nm處TMR的發(fā)射峰強(qiáng)度增強(qiáng)。以此熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)溶液中59 μmol/L鉈離子的檢測(cè)。Liu等[35]設(shè)計(jì)篩選出可形成G-四鏈體的富含T的對(duì)Hg2+和Pb2+具有親和力的核酸鏈，并在兩端分別標(biāo)記FAM和4-(4′-二甲氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)，首次實(shí)現(xiàn)以1條核酸適配體鏈同時(shí)檢測(cè)Hg2+和Pb2+。該體系還可包含多條適配體同時(shí)檢測(cè)多種重金屬，且互不干擾[36]。

圖1 基于適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變引發(fā)FRET檢測(cè)Tl+的原理[25]Fig.1 Principle of Tl+ detection based on fluorescence resonance energy transfer caused by structural transformation of aptamer[25]

與單標(biāo)記的熒光探針相比，雙熒光團(tuán)標(biāo)記的探針能更好地消除外界體系、核酸鏈分子、染料濃度等帶來(lái)的誤差。表1列出了一些單標(biāo)記和雙標(biāo)記的核酸適配體-熒光傳感器進(jìn)行比較。雙標(biāo)記體系增加了核酸適配體中修飾染料的種類和數(shù)量，往往存在修飾后的核酸鏈穩(wěn)定性減弱的問(wèn)題，同時(shí)雙標(biāo)記的熒光基團(tuán)也存在影響適配體與靶標(biāo)結(jié)合親和力的問(wèn)題。所以尋找穩(wěn)定的染料以及更好的修飾方法是雙標(biāo)記適配體熒光傳感技術(shù)發(fā)展的熱點(diǎn)。

表2 單標(biāo)記、雙標(biāo)記核酸適配體-熒光傳感器Table 2 Single and dual labeled nucleic acid aptamer-fluorescence sensor

1.3 基于特異性核酶(脫氧核酶)的標(biāo)記型

除了借助核酸的識(shí)別功能外，還可利用依賴重金屬的特異性脫氧核酶(DNAzyme)構(gòu)建酶型熒光傳感器。作為酶型傳感方法，這種熒光傳感器具有更好的專一性和更少的樣品消耗量。2000年，Lu課題組[20]利用依賴Pb2+的特異性DNAzyme構(gòu)建了檢測(cè)鉛的熒光傳感器(圖2A)，將底物鏈5′端標(biāo)記熒光團(tuán)，酶鏈的3′端標(biāo)記了猝滅基團(tuán)，當(dāng)?shù)孜锱c酶鏈雜交時(shí)，熒光團(tuán)與猝滅基團(tuán)相互靠近，使得熒光團(tuán)的熒光被猝滅；在體系中加入Pb2+后，特異性DNAzyme在輔助因子Pb2+的作用下，催化底物鏈切割導(dǎo)致DNA鏈斷裂，繼而熒光團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，實(shí)現(xiàn)體系熒光恢復(fù)。但該體系由于底物鏈與酶鏈的結(jié)合是分子間雜交，因此整個(gè)體系的熱力學(xué)穩(wěn)定性不高。為提高靈敏度，Lu課題組[37]后來(lái)在底物鏈上多修飾1個(gè)猝滅基團(tuán)，確保游離的熒光團(tuán)也能被猝滅以降低背景信號(hào)，該熒光傳感器對(duì)Pb2+的檢出限達(dá)35 nmol/L。Wang等[38]將底物鏈與酶鏈連接成環(huán)狀(圖2B),減少了多種熒光團(tuán)的修飾帶來(lái)的合成成本，同時(shí)提高熱力學(xué)穩(wěn)定性，檢出限為3 nmol/L。為實(shí)現(xiàn)更低的背景熒光，Zhang等[39]將底物鏈設(shè)計(jì)為分子內(nèi)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)底物鏈兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)(圖2C)；該體系中所需酶鏈無(wú)需標(biāo)記猝滅分子，可用少量酶鏈循環(huán)催化大量底物鏈水解，真正實(shí)現(xiàn)脫氧核酶的催化功能，同時(shí)提高傳感器靈敏度,該體系對(duì)Pb2+的檢出限為600 pmol/L。以上設(shè)計(jì)中，莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)與猝滅基團(tuán)結(jié)合緊密，更能有效猝滅熒光，以獲得更低的背景熒光信號(hào)和更高的信噪比。

圖2 基于DNAzyme的Pb2+探針及其工作原理示意圖[20,38-39]Fig.2 Principle of Pb2+ probe based on DNAzyme[20,38-39]

除上述Pb2+的DNAzyme外，科研工作者還篩選得到Hg2+、Cu2+、Mg2+等金屬離子的DNAzyme[40-42]，與天然酶相比，核酶/脫氧核酶具有合成步驟簡(jiǎn)單、理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)。此外，它們對(duì)金屬離子具有高度識(shí)別特異性。當(dāng)特定金屬離子存在時(shí)，顯示出酶活性,且活性的大小與體系中的金屬離子濃度呈正相關(guān)，使得它們?cè)诮饘匐x子檢測(cè)傳感器研究中具有重要位置。目前該領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向仍是篩選、優(yōu)化具有高催化活性、高識(shí)別特異性的核酶/脫氧核酶，以提高基于特異性核酶/脫氧核酶設(shè)計(jì)的相關(guān)傳感器的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性。

2 非標(biāo)記型適配體-熒光傳感技術(shù)

熒光團(tuán)標(biāo)記核酸適配體，易影響適配體與靶標(biāo)之間的親和力。為解決這一問(wèn)題，非標(biāo)記核酸適配體傳感體系得到了廣泛研究。非標(biāo)記核酸適配體傳感器主要依賴核酸適配體在構(gòu)象上的變化，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)形成以及空間位置的變化等，在無(wú)熒光團(tuán)標(biāo)記的情況下，利用外源熒光分子實(shí)現(xiàn)隨重金屬濃度變化而發(fā)生熒光信號(hào)的變化。傳統(tǒng)的熒光生色團(tuán)在高濃度或聚集狀態(tài)下分子之間的π-π堆積相互作用促使激發(fā)態(tài)能量以非輻射的方式耗散，從而導(dǎo)致熒光猝滅，出現(xiàn)聚集誘導(dǎo)猝滅現(xiàn)象[43](Aggregation-caused quenching,ACQ)，且傳統(tǒng)染料分子作為熒光信號(hào)源常被光漂白效應(yīng)破壞，這些現(xiàn)象曾嚴(yán)重制約發(fā)光材料的開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用。2001年，唐本忠課題組[44]發(fā)現(xiàn)一些特殊分子染料分散在溶液中時(shí)熒光微弱甚至觀察不到熒光，但聚集后熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，將這一現(xiàn)象稱為聚集誘導(dǎo)發(fā)光(Aggregation-induced emission，AIE)現(xiàn)象。具體機(jī)理是AIE分子以單體游離態(tài)被激發(fā)光激發(fā)后，被激發(fā)電子以分子內(nèi)振動(dòng)旋轉(zhuǎn)形式回到基態(tài)，不產(chǎn)生熒光；而當(dāng)AIE分子發(fā)生聚集時(shí)，被激發(fā)的電子無(wú)法通過(guò)分子內(nèi)振動(dòng)旋轉(zhuǎn)釋放能量回到基態(tài)，只能通過(guò)輻射方式釋放多余能量，從而產(chǎn)生熒光。不少AIE分子在溶液中以陽(yáng)離子形式穩(wěn)定存在，能夠與DNA骨架上的磷酸根負(fù)離子發(fā)生靜電作用，形成核酸鏈-AIE的復(fù)合物，當(dāng)功能核酸結(jié)合重金屬離子并折疊成特定結(jié)構(gòu)(雙鏈DNA、G-四鏈體、i-Motif等，見(jiàn)表3)后，核酸適體鏈-AIE復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更加緊湊，使得AIE分子聚集，體系熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)幾十甚至幾千倍。在一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度的變化與重金屬的濃度線性相關(guān)。基于此開發(fā)的非標(biāo)記適配體熒光傳感器具有信噪比高、抗漂白能力強(qiáng)的特點(diǎn)。

Li等[45]利用雙鏈螯合染料SYBR Green I(SGI)可插入汞誘導(dǎo)適配體形成的T-Hg2+-T雙鏈結(jié)構(gòu)，顯著增強(qiáng)體系的熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了Hg2+的檢測(cè)。且SGI與純T序列雙鏈結(jié)構(gòu)的親和力強(qiáng)于其他非純T序列[46]。SGI除可嵌入T-Hg2+-T、C-Ag+-C[47]結(jié)構(gòu)外，還能與易形成G-四鏈體的核酸適配體鏈結(jié)合發(fā)生AIE現(xiàn)象，基于該原理可實(shí)現(xiàn)1.6 nmol/L Pb2+的檢測(cè)[48]。除了SGI外，其他一些染料也可插入緊湊的核酸適配體結(jié)構(gòu)中。Ge等[49]添加硫黃素T(ThT)誘導(dǎo)結(jié)合富G序列折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，發(fā)生AIE現(xiàn)象，體系呈現(xiàn)強(qiáng)熒光狀態(tài)。若體系中有Hg2+，則可特異性地將G-四鏈體轉(zhuǎn)化為T-Hg2+-T雙鏈結(jié)構(gòu)，引起ThT的熒光強(qiáng)度降低(原理如圖3)。該方法可用于自來(lái)水和河水樣品中Hg2+的檢測(cè)，具有高靈敏度、寬線性范圍和良好選擇性。Li等[50]利用Zn-PPIX可嵌入Pb2+誘導(dǎo)的核酸適配體折疊成G-四鏈體后產(chǎn)生AIE效應(yīng)，成功設(shè)計(jì)了Pb2+的熒光傳感器。一些基于該方法的傳感器中的核酸適配體序列、染料分子、檢測(cè)對(duì)象以及方法檢出限列于表3。

表3 AIE分子識(shí)別的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及檢測(cè)的重金屬離子Table 3 DNA secondary structure recognized by AIE substances and heavy metal ions detected

圖3 基于硫黃素T的AIE特性檢測(cè)Hg2+的非標(biāo)記熒光傳感器[49]Fig.3 A label-free sensor for Hg2+ detection based on AIE induced by thioflavin-T[49]

標(biāo)記型核酸適配體-熒光傳感器較為常用，但標(biāo)記的熒光基團(tuán)會(huì)干擾適配體的識(shí)別能力，且成本高，耗時(shí)、費(fèi)力，這就使非標(biāo)記適配體熒光傳感技術(shù)對(duì)于分析檢測(cè)領(lǐng)域具有非常重要的意義?；谔厥獍l(fā)光性質(zhì)的染料分子或熒光基團(tuán)的非標(biāo)記適配體熒光傳感技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)的ACQ現(xiàn)象，而且能夠通過(guò)非標(biāo)記熒光團(tuán)與適配體體系簡(jiǎn)單混合實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的低成本快速、靈敏檢測(cè)。非標(biāo)記適配體熒光傳感技術(shù)正成為重金屬快速檢測(cè)分析研究的新方向。但就目前而言，可用的AIE分子相對(duì)較少且材料合成步驟繁瑣，報(bào)道的AIE分子大多發(fā)射波長(zhǎng)較短,熒光量子產(chǎn)率低，半峰寬不夠窄,這為構(gòu)建非標(biāo)記適配體熒光傳感器帶來(lái)一定的困難。要實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)條件下重金屬離子的特異性檢測(cè)，還需科研工作者開發(fā)更多結(jié)構(gòu)新穎、性能優(yōu)良的免標(biāo)記熒光材料來(lái)克服以上缺點(diǎn)。

3 納米材料輔助核酸適配體-熒光傳感技術(shù)

除了傳統(tǒng)的利用熒光染料和核酸適配體作用而構(gòu)建的適配體-熒光傳感器外，納米材料因其良好的生物兼容性、穩(wěn)定性等特性在適配體熒光傳感領(lǐng)域中具有標(biāo)記或增強(qiáng)信號(hào)，提高靈敏度的作用，也被廣泛應(yīng)用于重金屬檢測(cè)。常見(jiàn)的納米材料如貴金屬納米簇(AuNCs、AgNCs等)表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光特性，可作為新型熒光標(biāo)記物；碳納米材料(如氧化石墨烯、碳納米管等)常作為固定核酸適配體的載體以及熒光猝滅劑，優(yōu)化適配體的識(shí)別能力；量子點(diǎn)(Quantum dot,QD)等也可作為熒光傳感中的信號(hào)元件，提高檢測(cè)的靈敏度。

3.1 DNA穩(wěn)定的金屬納米簇輔助

金屬納米簇具有良好的光學(xué)性能，在檢測(cè)分析應(yīng)用中受到較多關(guān)注，可用于熒光檢測(cè)傳感器的構(gòu)建。在無(wú)穩(wěn)定劑的情況下，金屬納米簇將發(fā)生不可逆的聚集，而DNA是良好的穩(wěn)定劑。DNA穩(wěn)定的金屬納米簇輔助的熒光傳感器在檢測(cè)重金屬方面方便、快捷、靈敏，根據(jù)目標(biāo)物對(duì)核酸-納米簇復(fù)合物的作用機(jī)理不同，產(chǎn)生的信號(hào)變化也不盡相同。目標(biāo)物破壞復(fù)合物結(jié)構(gòu)，引起熒光猝滅，可構(gòu)建“Turn off”模式熒光傳感器；分析目標(biāo)物存在下增強(qiáng)金屬納米簇的熒光，可構(gòu)建“Turn on”模式熒光傳感器。

Zhu等[60]合成了核酸-金納米簇復(fù)合物(DNA-AuNCs)，若樣品中含有Hg2+，則與核酸適配體形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引起AuNCs的聚集，破壞復(fù)合物結(jié)構(gòu)，使DNA-AuNCs溶液從藍(lán)色熒光逐步猝滅。該方法可實(shí)現(xiàn)0.083 μmol/L Hg2+的檢測(cè)，拓寬了檢測(cè)實(shí)際樣品中Hg2+的方法。除DNA-AuNCs，核酸-銀納米簇復(fù)合物(DNA-AgNCs)因熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好且合成成本低也被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記和化學(xué)生物傳感中。Zhang等[61]利用核酸適配體和Cu2+的相互作用可猝滅DNA-AgNCs的熒光，實(shí)現(xiàn)了河水樣品中Cu2+的熒光分析，且該體系對(duì)銅離子特異性強(qiáng)，其他離子干擾小。此外，有報(bào)道稱熒光銅納米顆粒(CuNPs)可與雙鏈DNA形成dsDNA-CuNPs復(fù)合物，表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光特性，可作為新型熒光標(biāo)記物。Chen等[62]利用Pb2+對(duì)dsDNA-CuNPs熒光的選擇性猝滅作用，開發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記的熒光適配體傳感器，實(shí)現(xiàn)了尿液和河水樣品中5 nmol/L鉛的檢測(cè)。

除了一些重金屬離子可猝滅貴金屬納米簇外，還可以設(shè)計(jì)不同的核酸適配體，合成核酸-貴金屬納米簇，增強(qiáng)目標(biāo)物的熒光，如Liu等[63]發(fā)現(xiàn)DNA-AgNCs納米簇靠近富G序列時(shí)，熒光增強(qiáng)約500倍。Yin等[64]在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)2個(gè)DNA-AgNCs納米簇互相靠近時(shí)的熒光增強(qiáng)效果比靠近富G序列更好。基于相鄰DNA-AgNCs探針對(duì)的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，Zhang等[65]開發(fā)出銀納米團(tuán)簇功能化的適配體熒光傳感器檢測(cè)Pb2+。該方法利用Pb2+誘導(dǎo)適配體折疊成G-四鏈體，使核酸鏈兩端的DNA-AgNCs相互靠近，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。通過(guò)熒光信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的痕量檢測(cè)。Deng等[66]則使用DNA雙鏈穩(wěn)定的AgNCs作為熒光探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)水溶液中Hg2+的高選擇性檢測(cè)。

隨著金屬納米簇合成工藝以及表面修飾種類的豐富與發(fā)展，使得越來(lái)越多的金屬納米簇輔助的熒光分析方法得以構(gòu)建。

3.2 碳納米材料輔助

氧化石墨烯(GO)、碳納米管(CNT)、功能化氧化石墨烯、石墨炔等碳納米材料易溶于水，具有較好的生物相容性，可高效猝滅標(biāo)記在寡核酸鏈上的染料的熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的熒光檢測(cè)。基于此特點(diǎn)開發(fā)了多種檢測(cè)重金屬離子的熒光適配體傳感器。當(dāng)無(wú)目標(biāo)物存在時(shí)，單鏈DNA可通過(guò)核苷酸堿基和碳納米材料之間的疏水和π-π堆積相互作用自發(fā)地吸附到碳納米材料表面，使標(biāo)記的熒光團(tuán)猝滅以獲得較低的背景。重金屬誘導(dǎo)核酸鏈折疊成特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)后從碳納米材料上脫離，體系熒光得以恢復(fù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬的檢測(cè)。

Li等[67]利用GO作為吸附核酸載體以及熒光猝滅劑(如圖4)，該體系中不存在Pb2+時(shí)，適配體吸附在GO表面，熒光被有效猝滅。而當(dāng)體系中存在Pb2+時(shí)，Pb2+將核酸適配體單鏈誘導(dǎo)折疊為G-四鏈體結(jié)構(gòu)，使其脫離GO表面并恢復(fù)熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pb2+的高靈敏檢測(cè)(檢出限為400 pmol/L)。CNT的超猝滅能力也被用于重金屬熒光傳感器的開發(fā)，Taghdisi等[68]利用單壁碳納米管(SWCNT)作為吸附核酸載體以及熒光猝滅劑檢測(cè)Pb2+。Pb2+通過(guò)將游離單鏈誘導(dǎo)折疊為對(duì)SWCNT親和力弱的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，使標(biāo)記FAM的G-四鏈體從SWCNT的側(cè)壁脫離并恢復(fù)熒光，該體系實(shí)現(xiàn)了自來(lái)水和大鼠血清中Pb2+的檢測(cè)。利用碳納米材料的特性，還可開發(fā)用于檢測(cè)Hg2+[69]、Ag+[70]等的熒光適體傳感器。該體系還適用于多種單標(biāo)記核酸適體探針同時(shí)檢測(cè)體系中的多種重金屬離子，熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)的離子濃度表現(xiàn)出良好的線性依賴性，且這些探針之間無(wú)干擾效應(yīng)。Lu等[70]在GO輔助體系中加入多種單標(biāo)記核酸適體探針，實(shí)現(xiàn)了Hg2+、Pb2+和Ag+的同時(shí)檢測(cè)。相較于GO，多壁碳納米管(MWCNT)具有更高的表面積，可裝載多個(gè)分子并猝滅所有染料，Wang等[71]報(bào)道了基于適配體-MWCNT的多色熒光傳感器，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)均相溶液中的Hg2+、Ag+和Pb2+(檢出限分別為15、18、20 nmol/L)。與單目標(biāo)分析相比，多重分析可在單一溶液中檢測(cè)多種分析物，檢測(cè)快速簡(jiǎn)單，樣品和試劑消耗量低。

圖4 基于氧化石墨烯和G-四鏈體檢測(cè)Pb2+的熒光傳感原理[67]Fig.4 Principle of fluorescence sensing of Pb2+ based on graphene oxide and G-quadruplex DNA[67]

3.3 量子點(diǎn)輔助

在傳統(tǒng)的熒光傳感器中，有機(jī)染料分子用作熒光信號(hào)源，常被光漂白效應(yīng)破壞。標(biāo)記型適配體熒光傳感器因合成成本高限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。近年來(lái)，量子點(diǎn)輔助開發(fā)的適配體熒光傳感器引起了很多關(guān)注，不僅因?yàn)镼D具有出色的抗漂白性、量子產(chǎn)率高、熒光穩(wěn)定性好、壽命長(zhǎng)，而且因其穩(wěn)定的理化特性可作為熒光信號(hào)元件免受光漂白。從結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看，常用的QD可分為核心型和核殼型。核心型QD通過(guò)表面活性劑包封合成，可以提供足夠的發(fā)光強(qiáng)度以實(shí)現(xiàn)有效的能量傳輸，但其因表面缺陷致使發(fā)光量子產(chǎn)率不高。而核殼型QD憑借其獨(dú)特的核殼結(jié)構(gòu)可實(shí)現(xiàn)各層間的電荷轉(zhuǎn)移，提高了量子產(chǎn)率的同時(shí)保證了發(fā)光強(qiáng)度，廣泛應(yīng)用于熒光傳感器的開發(fā)。CdSe@ZnS是一種典型的核殼QD結(jié)構(gòu)。Li等[72]成功開發(fā)了CdSe@ZnS量子點(diǎn)輔助的檢測(cè)Pb2+的“Turn on”型適配體熒光傳感器。與“Turn off”型熒光傳感器相比，該體系的抗背景干擾能力更強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)90 pmol/L Pb2+的檢測(cè)。Liu等[73]則利用富G序列合成功能化CdS量子點(diǎn)(G-CdS QDs)，在K+存在下加入血紅素，形成G-四鏈體/血紅素復(fù)合物，電子從量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移至血紅素，發(fā)生熒光猝滅。體系中存在Pb2+時(shí)，Pb2+可以誘導(dǎo)K+穩(wěn)定的G-四鏈體/血紅素復(fù)合物發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而釋放出血紅素輔助因子，被血紅素猝滅的G-CdS QDs的熒光將再次恢復(fù)，這種變化基于Pb2+和PS2.M之間的特殊相互作用，對(duì)Pb2+的響應(yīng)幾乎不受其他金屬離子共存的影響[73]。Guo等[74]利用巰基乙酸(TGA)封端的CdTe QD實(shí)現(xiàn)了3.33 nmol/L Hg2+的檢測(cè)。開發(fā)易制備、易表征、量子產(chǎn)率高的材料，將為檢測(cè)真實(shí)樣品中的其他金屬離子提供巨大潛力。

納米材料輔助核酸適配體-熒光傳感可以解決影響標(biāo)記型核酸適配體-熒光傳感的多種問(wèn)題，與有機(jī)染料或抗體相比具有互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì)?；跓晒夥ū旧淼母哽`敏度特性以及納米材料的特殊光電效應(yīng)，使得納米材料輔助核酸適配體-熒光傳感技術(shù)在生物、環(huán)境等方面的分析應(yīng)用具有較大的發(fā)展?jié)摿?。盡管貴金屬納米材料以及量子點(diǎn)已廣泛用于生物傳感的開發(fā)，但隨著納米材料種類的擴(kuò)大以及檢測(cè)需求的增加，低成本的量子點(diǎn)新材料，反斯托克斯發(fā)光的上轉(zhuǎn)換粒子以及碳納米材料逐漸成為傳感器輔助材料的主流。將適配體與納米材料的光學(xué)特性相結(jié)合，可有效提高適配體的固定量，進(jìn)一步改善生物傳感器向更低檢出限、更高靈敏度和小型化方向發(fā)展，具有巨大的潛力，在這一領(lǐng)域的研究必會(huì)得到越來(lái)越多的關(guān)注。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

金屬作為潛在威脅物質(zhì)，即使微量接觸的情況下,也可能對(duì)人類健康和環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重危害。傳統(tǒng)檢測(cè)方法不能滿足重金屬離子的現(xiàn)場(chǎng)、快速、高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)需求。功能化核酸的出現(xiàn)為提高重金屬傳感器的設(shè)計(jì)提供了新的思路和平臺(tái)。隨著適配體篩選技術(shù)的快速發(fā)展，篩選出具有高特異性、高親和力的核酸適配體成為可能。另外，納米技術(shù)的發(fā)展也為優(yōu)良的熒光傳感體系提供了更好的發(fā)光或猝滅基礎(chǔ)。目前來(lái)看，未來(lái)熒光傳感技術(shù)在重金屬領(lǐng)域的應(yīng)用，傾向于借助納米技術(shù)來(lái)優(yōu)化體系的光學(xué)性能，提高方法的靈敏度，利用核酸適配體易于編輯、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)提高檢測(cè)方法的選擇性?？傮w來(lái)說(shuō)，該技術(shù)仍存在一些亟待開發(fā)和解決的問(wèn)題：一是砷和鉈等高毒性的重金屬離子適配體較少，選擇性較差或有待進(jìn)一步優(yōu)化，所以需要更優(yōu)的核酸適配體設(shè)計(jì)及篩選技術(shù)；二是缺乏評(píng)估核酸適配體與靶標(biāo)特異性結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)[75]，需要重視適配體的設(shè)計(jì)篩選與傳感器設(shè)計(jì)開發(fā)之間存在的差距，尋找特異性高、抗干擾能力強(qiáng)的核酸適配體；三是需將傳感器與試劑盒、試紙條、微流控芯片等結(jié)合，實(shí)現(xiàn)傳感器的微型化；四是實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的高效傳輸與數(shù)據(jù)處理，以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的快速、現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。總之，基于核酸適配體的熒光傳感技術(shù)在不斷的發(fā)展和完善，必將在生物醫(yī)藥、食品、環(huán)境等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用。