江秉澤 余思慧 張?zhí)N南 紀(jì)夢(mèng)迪 李佳欣 韋娟

(南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院 江蘇南京 210014)

糖尿病作為慢性非傳染性疾病具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率的特點(diǎn)，其中2型糖尿?。―iabetic Mellitus，DM）占據(jù)糖尿病患者的多數(shù)。機(jī)體臟器的胰島素抵抗是產(chǎn)生2型糖尿病的重要原因[1]，下丘腦是神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控中心，可以通過(guò)直接和間接調(diào)控維持血糖的穩(wěn)定，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。下丘腦的腹內(nèi)側(cè)核和腹外側(cè)核與攝食飲水有著重要的聯(lián)系，糖尿病患者常出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重減輕的“三多一少”現(xiàn)象[2]。張曉明對(duì)糖尿病大鼠下丘腦切片染色，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠下丘腦線(xiàn)粒體嵴消失，神經(jīng)元之間突出結(jié)構(gòu)蛻變，提示高糖環(huán)境下丘腦纖維化損傷嚴(yán)重[3]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一組與細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)的細(xì)胞因子，在機(jī)體受傷組織和愈合傷口、細(xì)胞分化能力高的組織較為常見(jiàn)。TGF-β在細(xì)胞中廣泛存在，但基本無(wú)生物學(xué)活性。TGF-β1與其受體結(jié)合后，下游蛋白Smad2/3發(fā)生磷酸化，與Smad4結(jié)合形成異源復(fù)合體，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)修復(fù)、組織纖維化等[4]。

二甲雙胍和運(yùn)動(dòng)作為常見(jiàn)改善糖尿病血糖干預(yù)措施，能有效提高外周血糖利用率，提高細(xì)胞外胰島素受體敏感性[5-6]。但關(guān)于藥物聯(lián)合抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠下丘腦損傷的研究較少，該研究利用糖尿病大鼠模型，檢測(cè)抗阻運(yùn)動(dòng)和二甲雙胍干預(yù)對(duì)下丘腦TGF-β1、Smad2/3蛋白表達(dá)影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑

TGF-β1、Smad2/3抗體（Proteintech Group，Rosemont），血糖儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司）、高速離心冷凍機(jī)（美國(guó)BEKMAN COULTER）。

圖1 抗阻訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)負(fù)荷圖

圖2 血糖變化趨勢(shì)圖

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，體重（145±15）g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境，晝夜自然節(jié)律變化，溫度（20±3）℃，相對(duì)濕度55%～75%，大鼠自由攝食飲水。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

50只SD雄性大鼠為期1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨即抽取10只為正常對(duì)照組。以普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，自由活動(dòng)，無(wú)運(yùn)動(dòng)干預(yù)。其余40只隨機(jī)分成4組，糖尿病組、藥物組、抗阻運(yùn)動(dòng)組、藥物聯(lián)合抗阻運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行糖尿病建模。高脂飼料喂養(yǎng)4周后，SD雄性大鼠停止飲食，不禁止飲水，以35mg/kg體重腹腔注射1%SZT注射液。對(duì)照組大鼠一次性注射同劑量的檸檬酸緩沖液（pH=4.4）。

正常組（NC組）自由活動(dòng)，正常飼料喂養(yǎng)，每日7.5ml/kg的雙蒸水灌胃1次；糖尿病組（D組）自由活動(dòng)，高糖高脂飼料喂養(yǎng)，每日7.5ml/kg的雙蒸水灌胃1次；藥物組（M組）自由活動(dòng)，高糖高脂飼料喂養(yǎng)，300mg/（kg·d）的份量與7.5ml/kg雙蒸水制成二甲雙胍懸濁液進(jìn)行灌胃1次；抗阻訓(xùn)練組（P組）抗阻訓(xùn)練，6周×6次/周；2組/d；3次/組，次間休息1min，組間休息2min。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷如圖1所示。

1.2.2 指標(biāo)的測(cè)定

大鼠飼養(yǎng)5周后測(cè)定血糖水平，腹腔注射1%的鏈脲佐菌素和檸檬酸紅沖液72h后再測(cè)定空腹血糖值，血糖值≥16.7mmol/L認(rèn)為造模成功，造模1周后進(jìn)行空腹血糖的復(fù)測(cè)，以確保糖尿病模型的成功。造模成功后實(shí)施分組干預(yù)方案，每2周為周期進(jìn)行空腹血糖檢測(cè)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

干預(yù)結(jié)束后，所有大鼠禁食禁水48h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，解剖取血后，將大鼠顱骨沿正中剪開(kāi)，暴露全腦，在冰盤(pán)上迅速剝離下丘腦，將下丘腦組織放入2cm的含有編號(hào)凍存管中放入液氮中保存，后移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。從上述大鼠中提取下丘腦組織存于-80℃冰箱，每個(gè)樣本取0.1g大鼠下丘腦組織，使用碧云天RIPA裂解液提取蛋白、根據(jù)Thermo Scientific的BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。調(diào)節(jié)蛋白濃度為5μg/μl，經(jīng)5×loading buffer稀釋后，蛋白濃度為4μg/μl，上樣量為15μl，聚丙烯凝膠電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜?？焖俜忾]液封閉15min，一抗過(guò)夜，次日TBST洗膜3次，5min/次。二抗孵育，結(jié)束后TBST洗膜3次，5min/次。洗凈后，ECL化學(xué)發(fā)光液孵育3min，使用數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)顯影，Image lab分析條帶灰度值。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均用JMP 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式表現(xiàn)，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用雙因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P＜0.05作為差異顯著性的界值。

2 結(jié)果

2.1 血糖

如圖2所示，造模前各組內(nèi)無(wú)明顯差異。2周后M組與D組比較，血糖水平顯著下降（P＜0.05），P組血糖有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MP組血糖顯著降低（P＜0.01），M組和MP組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。4周后，M組與D組對(duì)比，血糖水平顯著下降（P＜0.05），MP組較D組血糖顯著下降（P＜0.01），MP組較M組，降血糖效果降低（P≤0.05），P組血糖水平下降，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。6周后，M組血糖水平對(duì)比D組有所下降，P組血糖下降（P＜0.05）。MP能夠顯著降低糖尿病血糖（P＜0.01），但降血糖水平低于單純藥物干預(yù)（P＜0.05），P組和MP組血糖值無(wú)明顯差異（P＞0.05）?？v向比較，隨著藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，降血糖效果無(wú)顯著性差異（P＞0.05），隨著運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，降血糖效果無(wú)明顯差異（P＞0.05），隨著聯(lián)合干預(yù)的時(shí)間的延長(zhǎng)，第6周降血糖水平較第4周下降較為明顯（P＜0.05）。

圖3 Western-blot檢測(cè)各組大鼠TGF-β1-Smad2/3蛋白表達(dá)

2.2 Western-blot結(jié)果

如圖3、圖4所示，結(jié)果顯示糖尿病組大鼠下丘腦TGF-β1高于正常組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），藥物組和抗阻組TGF-β1略低于糖尿病組，但仍高于正常組，且均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），藥物聯(lián)合抗阻運(yùn)動(dòng)組TGF-β1表達(dá)量略低于糖尿病組，但高于抗阻組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Smad2糖尿病組表達(dá)量較正常組升高，抗阻組和藥物組均有一定的升高，抗阻聯(lián)合藥物組升高趨勢(shì)最為明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），Smad3各組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

抗阻訓(xùn)練作為常用的訓(xùn)練方式，可以多方面訓(xùn)練軀體的肌肉群，增加肌肉對(duì)血糖的攝取利用，增加胰島素受體的數(shù)量和敏感性[7]，起到降低血糖的作用。二甲雙胍作為一種常用的臨床藥物，通過(guò)AMPK途徑激活PKC，調(diào)控下游蛋白發(fā)生磷酸化，抑制肝臟糖異生和促進(jìn)外周組織對(duì)血糖的攝取利用。該研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和二甲雙胍單獨(dú)干預(yù)均可以使糖尿病大鼠血糖水平下降[8-9]，這與以往研究一致。該研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍藥物干預(yù)2周后，M組血糖水平明顯低于D組；抗阻訓(xùn)練干預(yù)后，在6周訓(xùn)練前血糖水平無(wú)明顯的改變，提示抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠的血糖降低效果與持續(xù)訓(xùn)練的周期有著密切的聯(lián)系，至少要持續(xù)6周的負(fù)重抗阻訓(xùn)練才能起到降血糖的作用。與預(yù)期相反，抗阻運(yùn)動(dòng)和二甲雙胍聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠血糖的調(diào)控效果相似，隨著運(yùn)動(dòng)周期的延長(zhǎng)，甚至有所下降，提示運(yùn)動(dòng)和二甲雙胍對(duì)血糖降低可能存在一定的拮抗作用。沈文清認(rèn)為[10]，這種抑制作用可能是運(yùn)動(dòng)干預(yù)抑制了二甲雙胍藥物動(dòng)力學(xué)活性，同時(shí)二甲雙胍抑制了線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性，且運(yùn)動(dòng)本身會(huì)加強(qiáng)肝糖原釋放，補(bǔ)充運(yùn)動(dòng)過(guò)程中血糖的消耗，血糖上升，這種運(yùn)動(dòng)血糖上升的機(jī)制與二甲雙胍降血糖的作用相悖，所以降低了二甲雙胍的降血糖效果。此外，二甲雙胍可以通過(guò)對(duì)三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，降低線(xiàn)粒體ROS水平[11]，但運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，能量消耗增加，線(xiàn)粒體氧化磷酸化水平增加，ROS產(chǎn)生增多[12]。與上述結(jié)論相反，黃安華[13]發(fā)現(xiàn)1年抗阻運(yùn)動(dòng)結(jié)合二甲雙胍服用，可以有效地改善胰島素抵抗指數(shù)，對(duì)血糖水平也有著明顯的改善作用。沈文清[14]發(fā)現(xiàn)急性運(yùn)動(dòng)結(jié)合二甲雙胍干預(yù)較單獨(dú)干預(yù)能夠更加顯著地改善2型糖尿病小鼠血糖穩(wěn)態(tài)和肝臟糖異生情況。對(duì)于這種不同的現(xiàn)象，可能與二甲雙胍服用的劑量、藥物服用與運(yùn)動(dòng)的間隔時(shí)間、運(yùn)動(dòng)的方式、運(yùn)動(dòng)劑量密切相關(guān)。把握運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和藥物服用的時(shí)間，逆轉(zhuǎn)兩者疊加的抵消作用是藥物治療和運(yùn)動(dòng)治療結(jié)合的關(guān)鍵之處。

TGF-β1是Smad2/3的上游蛋白，與器官的纖維化有著密切的聯(lián)系。在高糖環(huán)境下，各器官臟器都出現(xiàn)了纖維化的現(xiàn)象，器官的形態(tài)和功能都受到了嚴(yán)重的影響。張曉明[3]對(duì)糖尿病大鼠的肝臟、腎臟和下丘腦等組織進(jìn)行了染色切片，發(fā)現(xiàn)上述器官的纖維化水平對(duì)照正常大鼠明顯加劇。與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，此實(shí)驗(yàn)通過(guò)Westernblot的方式對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，D組大鼠下丘腦TGF-β1、Smad2/3表達(dá)水平與C組均無(wú)明顯差異。此外，分別將P組、M組和MP組與D組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組之間的TGF-β1和Smad2/3蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異。施若黎[15]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠高脂飼料喂養(yǎng)后，15mg/kg劑量2次腹腔注射2%SZT注射液建模，染色切片發(fā)現(xiàn)下丘腦纖維化程度嚴(yán)重，糖尿病大鼠TSP-1、TGF-β1表達(dá)量上調(diào)。實(shí)驗(yàn)大鼠以35mg/kg腹腔注射1%SZT注射液建模，D組和C組TGF-β1、Smad2/3蛋白尚未發(fā)現(xiàn)差異，提示糖尿病器官損傷可能和建模STZ注射劑量相關(guān)。修賢杰[16]認(rèn)為小劑量的STZ多次注射聯(lián)合高糖高脂飲食是較佳的糖尿病大鼠建模方式，較好地模擬了糖尿病代謝特征和進(jìn)展過(guò)程，而一次性大劑量注射可能會(huì)引起胰島細(xì)胞的過(guò)度損傷，糖尿病大鼠成模率下降，死亡率提高。同批次大鼠的心肌的TGF-β1表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)[17]，發(fā)現(xiàn)D組和P組發(fā)生顯著性提高，與D組相比，M組、P組MP組的蛋白表達(dá)量卻明顯下降。由此推測(cè)，高糖環(huán)境對(duì)于同一個(gè)體的不同器官的毒害進(jìn)程存在時(shí)間順序，《中國(guó)糖尿病指南》依照糖尿病腎病進(jìn)展，將糖尿病分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四期，隨著糖尿病進(jìn)程逐漸加劇，推測(cè)糖尿病下丘腦損傷也存在時(shí)間進(jìn)程的差異，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，未對(duì)該批糖尿病大鼠下丘腦染色切片，觀察下丘腦損傷程度。尚不能認(rèn)為此實(shí)驗(yàn)6周高糖環(huán)境對(duì)下丘腦造成損傷。

圖4 TGF-β1、smad2/3條帶圖