李夢月，黎發(fā)宏，蘭明先，李 強，任梅蓉*，吳國星*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南昆明 650201；2.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明 650224）

【研究意義】長序三寶木（Trigonostemon howii）為大戟科（Euphorbiaceae）三寶木屬（Trigonostemon）植物，是海南傳統(tǒng)藥用植物，其化學成分多樣，結(jié)構(gòu)新穎獨特且具有良好的生物活性，包括抗腫瘤，抗HIV，抗氧化，抗炎等活性[1-4]?！厩叭搜芯窟M展】近年來國內(nèi)外諸多專家學者對三寶木屬植物進行了化學成分及生物活性研究，發(fā)現(xiàn)三寶木屬植物典型化合物類型多為高度衍生化的瑞香烷型二萜、降二萜、生物堿等，其中也含有香豆素類，菲類，酚類，甾體，苯丙苯素類等其他類型化合物[5-7]。其中的部分化合物不僅結(jié)構(gòu)新穎獨特，而且具有良好的抗腫瘤，抗菌和殺蟲活性[8-9]?！颈狙芯壳腥朦c】與長序三寶木化學成分及抗氧化生物活性相關的文獻報道較少。鑒于三寶木屬植物不僅化合物類型多樣，而且具有良好的生物活性[10-12]，因此在分析長序三寶木化學成分的基礎上，研究該植物的其他生物活性，對開發(fā)利用好這一傳統(tǒng)藥物資源具有重要的實踐指導意義[13]。【擬解決的關鍵問題】本文對長序三寶木的抗氧化化學成分進行分離鑒定，并對部分化合物進行清除DPPH自由基和羥基自由基活性測試，為進一步開發(fā)利用長序三寶木資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Bruker AM-400，DRX-500和BrukerAvance III 600型核磁共振儀（Bruker公司）；API Qstar Pulsar 1質(zhì)譜儀（waters公司）；Agilent1200系列半制備高效液相色譜儀（Agilent公司）；Zorbax SB-C18 column色譜柱（5.0μm，9.4×250 mm），二極管陣列檢測器（DAD）；AY220電子天平（d=0.01 mg，日本島津）；低溫冷卻循環(huán)泵（DLSB-40型，陜西愛信儀器有限公司）；隔膜真空泵（V-100型，瑞士BUCHI公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100型）、電熱恒溫水浴鍋（OSB-2100型，上海愛朗儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（DHG-924OA型，上海一恒科學儀器有限公司）；MCI gelCHP 20P（日本三菱公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（GE公司）；正相層析硅膠（60～80目，80～100目，300～400目）、制備型薄層層析硅膠GF254、預制硅膠板（青島海洋化工廠）；反相色譜硅膠C18（40～75 μm）（Fuji Silysia化學公司）；顯色劑（10%硫酸∕乙醇、碘:層析缸內(nèi)放入碘結(jié)晶與60～80目硅膠混勻）；色譜純甲醇、乙腈（天津科密歐公司）；氘代試劑（Merck公司）；其他試劑均為分析純。

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）為分析純（美國Sigma公司）；維生素C（Vc）為分析純（中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司）；酶標分析儀（北京市普朗新技術(shù)有限公司）；IC50值用GraphPad Prism software（version 7.0.0）軟件計算而得。

長序三寶木枝葉于2018年10月采自海南省三亞市，植物標本由中國科學院昆明植物研究所彭華研究員鑒定，憑證標本（H20111201）存放于中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 長序三寶木化學成分的分離純化 自然陰干的長序三寶木10 kg，粉碎后用甲醇加熱回流提取3次，每次3 h，合并提取液，真空蒸發(fā)溶劑，得到總浸膏。將總浸膏加適量水形成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，回收溶劑，分別得到石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層。采用DPPH法篩查出抗氧化活性較好的萃取部分，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)正丁醇層抗氧化活性較石油醚層、乙酸乙酯層好，故選取正丁醇層進行化合物的分離純化。

將正丁醇層樣品用60～80目硅膠拌樣，200～300目硅膠裝柱，采用干法上樣進行硅膠柱層析分離。以二氯甲烷-乙酸乙酯（體積比100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1）為洗脫劑進行梯度洗脫，經(jīng)TLC薄層層析檢測合并主點相同的組分，共得5個組分（A-E）。

組分A經(jīng)凝膠Sephadex LH-20（V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1）柱層析，合并相同主點組分得到4個亞組分（A1-A4），A2亞組分經(jīng)半制備HPLC純化得化合物4（21.3 mg）。

組分B經(jīng)過MCI層析柱，以甲醇-丙酮（體積比60∶40、70∶30、80∶20、100∶0）為洗脫劑進行梯度洗脫，合并相同主點組分得到3個亞組分（B1-B3）。B1亞組分經(jīng)過凝膠Sephadex LH-20（V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1）柱層析，合并相同主點組分得到B11、B12亞組分；B12組分進一步經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（體積比20∶1、10∶1、6∶1、4∶1、2∶1）為洗脫劑進行梯度洗脫得到化合物8（16.4 mg）。B2亞組分經(jīng)過凝膠Sephadex LH-20（V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1）柱層析后經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物6（11.6 mg）。B3亞組分經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（體積比15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1）為洗脫劑進行梯度洗脫得到化合物7（12.9 mg）。

組分C經(jīng)凝膠Sephadex LH-20（V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1）柱層析，合并相同主點組分得到3個亞組分（C1-C3）。C2亞組分經(jīng)凝膠Sephadex LH-20（V（甲醇）∶V（水）=1∶1）柱層析后經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物1（9.8 mg）。C3亞組分經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（體積比15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1）為洗脫劑進行梯度洗脫得化合物5（46.8 mg）。

組分D經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-乙酸乙酯（體積比30∶1、20∶1、10∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1）為洗脫劑進行梯度洗脫，合并相同主點組分得到3個亞組分（D1-D3）；D2亞組分經(jīng)凝膠Sephadex LH-20（V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1）柱層析后經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物3（9.8 mg）。

組分E經(jīng)過MCI層析柱，以甲醇-丙酮（體積比60∶40、70∶30、80∶20、100∶0）為洗脫劑進行梯度洗脫，合并相同主點組分得到2個亞組分（E1-E2），E2亞組分經(jīng)凝膠Sephadex LH-20（V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1）柱層析后經(jīng)半制備HPLC純化得到化合物2（11.2 mg）。

1.2.2 DPPH自由基清除實驗 DPPH（1，1-二苯基苦?；诫拢┳杂苫袉坞娮?，在517 nm處有強吸收，其醇溶液呈紫色。當有自由基清除劑存在時，由于自由基清除劑與其單電子配對從而使其在517 nm處的吸收值變小，其接收電子的數(shù)量與其褪色程度成定量關系，可用酶標儀進行快速定量分析[14]。

用體積分數(shù)99%乙醇將DPPH配制成濃度為50 μmol∕L的溶液，化合物用甲醇溶解成40 μmol∕L母液。向96孔板中依次加入體積分數(shù)99%乙醇80μL，50μmol∕L的DPPH自由基溶液10μL，化合物樣品10μL，避光震蕩混勻。30 min后以體積分數(shù)99%的乙醇作為空白對照于517 nm下測定吸光度，每個樣品設置5個梯度，并各設置3個復孔。

以體積分數(shù)99%乙醇作為對照組，Vc作為陽性對照[15]。根據(jù)公式（1）計算清除率:

式（1）中，A0為未加樣品組的吸光值，A1為樣品組吸光值，A2為空白組吸光值。

1.2.3 清除羥自由基實驗 向96孔板中依次加入濃度為0.2 mmol∕L磷酸鹽緩沖液（pH=8）100μL，濃度為7.5 mmol∕L的鄰二氮菲25μL，濃度為7.5 mmol∕L的硫酸亞鐵25μL，再加入化合物樣品溶液25μL，最后加入0.1%H2O225μL，37°C保溫50 min[16]。以99%乙醇作為空白對照，以VC作為陽性對照，536 nm處測定吸光值A0，設置5個梯度平行操作3次，計算自由基清除率（Y）:

式（2）中，A1為99%乙醇代替化合物樣品的吸光值；A2為99%乙醇代替H2O2的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 長序三寶木化合物的鑒定

由圖1可知，從長序三寶木中分離鑒定了8個化合物，均為首次從該植物中分離得到。

化合物1的鑒定:淡黃色粉末，分子式為C16H12N2O3，ESI-MSm/z:281.1[M+H]+，1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ:8.80（1H，d，J=5.2 Hz，H-2），8.60（1H，d，J=7.6 Hz，H8），8.05（1H，d，J=7.6 Hz，H-11），7.90（1H，d，J=5.2 Hz，H-1），7.66（1H，t，J=7.6 Hz，H-9），7.47（1H，t，J=7.6 Hz，H-10），4.44（3H，s，OCH3-5），4.05（3H，s，OCH3-4），13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ:116.6（C-1），144.8（C-2），152.4（C-4），140.0（C-5），158.0（C-6），115.3（C-8），130.6（C-9），125.1（C-10），122.3（C-11），124.3（C-12），138.8（C-13），129.8（C-14），128.0（C-15），133.0（C-16），77.0（OCH3-4），61.3（OCH3-5），上述數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致，故化合物1鑒定為4，5-二甲氧基鐵屎米酮（4，5-dimethoxycanthin-6-one）。

化合物2的鑒定:白色粉末，分子式為C9H12N2O6，ESI-MSm/z:267[M+Na]+，1H-NMR（MeOD，500 MHz）δ:37.86（1H，d，J=8.0 Hz，H-6），5.88（1H，d，J=4.8 Hz，H-1′），5.86（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），4.33（1H，t，J=4.8 Hz，H-2′），4.23（1H，t，J=5.2 Hz，H-3′），4.12（1H，m，H-4′），3.91（1H，dd，J=12.4，2.8 Hz，H-5′a），3.80（1H，dd，J=12.4，4.4 Hz，H-5′b）;13C-NMR（MeOD，125 MHz）δ:166.1（C-4），151.6（C-2），141.9（C-6），102.3（C-5），89.48（C-1′），84.33（C-4′），73.88（C-2′），69.56（C-3′），60.87（C-5′），上述數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致，故化合物2鑒定為尿苷（uridine）。

化合物3的鑒定:淡黃色晶體，分子式為C10H8O4，ESI-MSm/z:193[M+H]+，1H-NMR（MeOD，600 MHz）δ:7.86（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），7.11（1H，s，H-8），6.77（1H，s，H-8），6.20（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），3.91（3H，s，OCH3-6）；13C-NMR（MeOD，150 MHz）δ:164.0（C-2），112.6（C-3），146.2（C-4），112.6（C-3），146.2（C-4），110.1（C-5），147.1（C-6），151.4（C-7），104.0（C-8），152.9（C-9），112.6（C-10），56.8（OCH3-6），上述數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，故鑒定化合物3為東莨菪內(nèi)酯（scopoletin）。

化合物4的鑒定:無色油狀物，分子式為C17H16O11，ESI-MSm/z:419[M+Na]+，1H-NMR（MeOD，500 MHz）δ:3.63（6H，s，OOCH3-12，13），3.68（3H，s，OOCH3-14），5.28（1H，d，J=14.4 Hz，H-1），5.35（1H，d，J=14.4 Hz，H-2），6.80（1H，d，J=2.0 Hz，H-4），7.04（1H，d，J=2.4 Hz，H-8）；13C-NMR（MeOD，125 MHz）δ:171.4（C-11），67.3（C-13），167.1（C-12），166.8（C-14），146.8（C-6），144.2（C-5），143.0（C-3），140.5（C-7），130.3（C-4），117.7（C-10），116.2（C-9），108.7（C-8），80.2（C-1），53.5（OCH3-14），53.0（OCH3-14），52.6（OCH3-13），35.7（C-2），上述數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致，故化合物4鑒定為trimethyl-3，4-dehydrochebulate。

化合物5的鑒定:黃色晶體，分子式為C8H8O5，ESI-MSm/z:185[M+H]+，1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ:3.81（3H，s，-COOCH3），7.04（2H，s，H-2，6）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ:169.2（C=O），146.7（C-3，5），139.9（C-4），121.6（C-1），110.2（C-2，6），上述數(shù)據(jù)與文獻[21]報道一致，故化合物5鑒定為沒食子酸甲酯（methylgallate）。

化合物6的鑒定:淡黃色油狀物，分子式為C11H14O5，ESI-MSm/z:249[M+Na]+，1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ:4.09（1H，dd，J=12.9，10.5 Hz，Ha-3），3.80（1H，dd，J=12.9，5.3 Hz，Hb-3），3.72（1H，dd，J=10.5，5.3 Hz，H-2）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ:146.7（s，C-4′）.145.3（s，C-3′），121.2（d，C-6′），114.7（d，C-2′），110.5（d，C-5′），56.0（q，MeO-3′），53.5（d，C-2），52.2（q，MeO-1），上述數(shù)據(jù)與文獻[22]報道一致，故化合物6鑒定為ficusol。

化合物7的鑒定:白色針晶，分子式為C13H20O3，ESI-MSm/z:247[M+Na]+，1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ:5.88（1H，s，H-4），5.80（1H，m，H-7），5.79（1H，m，H-8），4.32（1H，m，H-9），2.48（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.16（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），1.92（3H，s，H-11），1.24（3H，s，H-10），1.04（3H，s，H-12），1.02（3H，s，H-13）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ:42.6（C-1），51.0（C-2），201.4（C-3），127.3（C-4），167.6（C-5），80.2（C-6），130.2（C-7），137.1（C-8），68.8（C-9），24.0（C-10），19.7（C-11），23.7（C-l2），24.7（C-13），上述數(shù)據(jù)與文獻[23]報道一致，故化合物7鑒定為吐葉醇（blumenol A）。

化合物8的鑒定:無色油狀物，分子式為C13H20O3，ESI-MSm/z:247[M+Na]+，1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ:1.06（3H，s，H-10），1.26（3H，s，H-12），1.31（3H，s，H-11），2.12（3H，s，H-13），2.07（1H，dd，J=12.7 Hz，H-4a），1.20（1H，dd，H-4b），1.18（1H，dd，H-2a），1.82（1H，dd，J=12.5 Hz，H-2b），4.04（1H，m，H-3），5.76（1H，s，H-8）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ:209.6（C-7），198.3（C-9），119.2（C-6），100.0（C-8），71.1（C-5），62.5（C-3），50.0（C-2），49.7（C-4），36.0（C-1），32.1（C-10），30.8（C-12），29.2（C-11），26.6（C-13），上述數(shù)據(jù)與文獻[24]報道一致，故鑒定化合物8為蚱蜢酮（grasshopper ketone）。

圖1 化合物1-8的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-8

2.2 化合物清除DPPH自由基的活性

針對從正丁醇層中分離得到的帶有酚羥基的化合物進行清除DPPH自由活性測試，觀察化合物濃度與自由基清除率量效圖（圖2）可發(fā)現(xiàn):以Vc作為陽性對照，化合物4、5和6均具有清除DPPH自由基的活性，且具有劑量依賴性。隨著化合物濃度降低，其DPPH自由基清除率也降低。在相同濃度條件下，對DPPH自由基清除效率由高到低依次為化合物5、Vc、化合物4和化合物6；其中化合物5清除DPPH自由基活性最強，其IC50僅為0.23μmol∕L，比陽性對照Vc強22倍，化合物6活性最弱，其IC50為15μmol∕L。

圖2 DPPH自由基清除率量效Fig.2 DPPH radical scavenging efficiency

2.3 化合物清除羥基自由基的活性

針對從正丁醇層層中分離得到的帶有酚羥基的化合物進行清除羥基自由活性測試，觀察化合物濃度與自由基清除率量效圖（圖3）可發(fā)現(xiàn)，以Vc作為陽性對照，化合物4、5和6同樣也都具有清除羥基自由基的活性，且也具有劑量依賴性；隨著化合物濃度降低，其羥基自由基清除率也降低。在相同濃度條件下，對羥基自由基清除效率由高到低依次為化合物5、Vc、化合物4和化合物6；其中化合物5同樣也對羥基自由基具有最強清除力，其IC50僅為0.71μmol∕L，比陽性對照Vc強20倍，化合物6活性最弱，其IC50為26μmol∕L。

圖3 羥基自由基清除率量效Fig.3 Hydroxyl radical scavenging efficiency

3 結(jié)論與討論

本研究主要針對長序三寶木中抗氧化活性較好的正丁醇層萃取物進行分離純化出8個化合物，其中主要抗氧化物質(zhì)為trimethyl-3，4-dehydrochebulate（化合物4），沒食子酸甲酯（化合物5），ficusol（化合物6）；其中含量最多，活性最強的為沒食子酸甲酯（化合物5）其抗氧化活性比Vc強20倍。這說明化合物5為長序三寶木正丁醇層萃取物中抗氧化的最主要成分。并且此次分離得到的具有抗氧化活性的化合物均有劑量依賴性，結(jié)合在分離純化過程中化合物表現(xiàn)出的理化性質(zhì)及其構(gòu)效關系，可知化合物的抗氧化能力主要來源于其結(jié)構(gòu)中的酚羥基，其清除自由基的能力可能還與結(jié)構(gòu)中連接的酚羥基數(shù)目、連接位置、相鄰基團及輔助基團等因素有關，其酚羥基數(shù)目越多抗氧化能力越強。

針對本研究抗氧化能力最強的化合物5沒食子酸甲酯，最新研究發(fā)現(xiàn)其還具有較好的抗腫瘤、抗炎、抑菌等生物活性。如沒食子酸甲酯可以通過引起細胞自噬凋亡從而對結(jié)腸癌細胞起到抑制作用[25]；其通過上調(diào)抗氧化酶，抑制對逆轉(zhuǎn)錄酶，蛋白酶和整合酶等對HIV生命周期至關重要的3種關鍵酶，從而抑制偽病毒感染的TZM-BL細胞中的HIV-1增殖[26]。其次，沒食子酸甲酯均能不同程度抑制白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子[27]。同時，沒食子酸甲酯可以通過抑制細菌QS系統(tǒng)的機制從而提高對細菌的耐藥性，從而使其成為開發(fā)新的可替代抗生素的候選藥物[28]；其還對銅綠假單胞菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌亞種有顯著的抑制作用[29]。此外，沒食子酸甲酯對氨酸酶[30]，致齲菌細胞內(nèi)蔗糖酶均具有較強的抑制作用[31]。但關于沒食子酸甲酯這些生物活性具體的構(gòu)效關系研究較少。

此外，三寶木屬植物豐富多樣的化學成分，結(jié)構(gòu)類型新穎獨特，如最新研究發(fā)現(xiàn)的新型碳骨架的四氫呋喃衍生物trigonohowine[31]，新型二聚體二萜類化合物trigonostemon G和trigonostemon H[32]，新的鞣花單寧類化合物lutescins A和lutescins B[33]，新型生物堿trigonostemine G和trigonostemone J[34]，罕見的3，4-二萜骨架化合物heterophypene A和heterophypene B以及其他的二萜化合物[35-37]。并且這些化合物均有較好的抗增殖，抗結(jié)核，抗炎等生物活性[38]，故繼續(xù)深入探究三寶木屬植物其他新穎化學成分及其生物活性，將進一步拓寬治療心腦血管疾病、腫瘤和神經(jīng)退行性疾病尋找到新的藥物來源，為天然抗氧化劑、天然食品添加劑研究與開發(fā)開辟新的道路。

致謝：中國科學院昆明植物研究所丁驍助理研究員對研究給予幫助，謹致謝意!