劉鵬波 張耀文 趙 艷 郁春云 曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽 110122)

瘧疾是由瘧原蟲感染所引起的一種古老的嚴(yán)重危害人體健康的蟲媒疾病(周吉坤等，2015)。僅在2018年，全世界大約有2.28億例瘧疾感染病例，其中有40.5萬人死于瘧疾。感染人類的多種瘧原蟲中，間日瘧原蟲在全球范圍內(nèi)的分布最廣，且在非洲以外地區(qū)的感染病例最多(WHO，2020)。間日瘧原蟲具有復(fù)雜的生物學(xué)特性，感染早期配子體在出現(xiàn)癥狀前就出現(xiàn)在外周血使其擁有更長的傳播窗口期。同時(shí)，它具有侵染網(wǎng)織紅細(xì)胞的傾向性，因此很難獲得體外連續(xù)培養(yǎng)，使開發(fā)有效的抗瘧措施是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的任務(wù)。此外，有研究證據(jù)表明，間日瘧原蟲在中緬邊境流行區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了對氯喹等抗瘧藥物敏感性降低的現(xiàn)象(胡月，2016)。間日瘧原蟲在與惡性瘧原蟲共同流行地區(qū)的優(yōu)勢地位日益增強(qiáng)，突出了針對間日瘧原蟲開發(fā)新控制措施的必要性，包括開發(fā)出高效的疫苗等。然而，與惡性瘧原蟲相比，間日瘧原蟲疫苗的研發(fā)依然處于早期臨床前階段，疫苗新的候選抗原篩選依然是當(dāng)前工作的重心。而在間日瘧原蟲感染早期不斷產(chǎn)生有性階段的雌、雄配子體對其實(shí)現(xiàn)有效的傳播至關(guān)重要，這說明針對瘧原蟲有性階段的傳播阻斷疫苗可能是消滅間日瘧在人群中傳播的一項(xiàng)重要措施。

傳播阻斷疫苗以瘧原蟲有性階段以及按蚊中腸期蛋白為抗原。但目前為止，雖然研究了較多的傳播阻斷疫苗的候選抗原，但其中僅有一小部分表現(xiàn)出來傳播阻斷活性(TRA)。傳播阻斷疫苗的發(fā)展目前主要集中在瘧原蟲生命周期中的3個(gè)階段，包括受精前抗原Pfs230(Farranceetal.，2011)和Pfs48/45(Outchkourovetal.，2008)，受精后抗原Pfs25(Wuetal.，2008)和Pfs28(Duffyetal.，1997)以及蚊中腸抗原AgAPN1(Dinglasanetal.，2007)。

最近研究表明，HAP2/GCS1蛋白具有成為新一代TBV候選抗原的潛質(zhì)。HAP2/GCS1蛋白最初于擬南芥中發(fā)現(xiàn)(von Besseretal.，2006)，并且廣泛存在于包括植物、多細(xì)胞生物、無脊椎動物、藻類以及致病性和非致病性原生生物在內(nèi)的多種真核生物中。HAP2是由單一的跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外結(jié)構(gòu)域和相對較短的胞內(nèi)區(qū)所構(gòu)成的高度保守的蛋白(Fédryetal.，2017, Fedryetal.，2018)。在對衣藻、擬南芥和四膜蟲HAP2的結(jié)構(gòu)和功能研究表明，HAP2是一種配子膜融合蛋白，與Ⅱ類病毒融合蛋白同源(Fédryetal.，2017, Pinelloetal.，2017, Fengetal.，2018)。在膜融合的過程中，一個(gè)由～40氨基酸(AA)保守區(qū)組成的疏水環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要的作用(Fédryetal.，2017)。HAP2存在于所有瘧原蟲的基因組中，伯氏瘧原蟲PbHAP2基因的破壞可以阻止按蚊中腸雌、雄配子的受精和隨后在按蚊中的發(fā)育(Hiraietal.，2008, Liuetal.，2008)。PbHAP2是一種在雄性配子表面表達(dá)的雄性生育因子，為雌性和雄性配子膜融合所必需(Hiraietal.，2008, Liuetal.，2008)。雖然PbHAP2僅參與了配子的融合，并未參與雌、雄配子的黏附結(jié)合過程，同時(shí)抗PbHAP2抗體可在體內(nèi)、外引起較強(qiáng)的傳播阻斷效應(yīng)(TRA)(Blagboroughetal.，2009)。在小麥胚芽無細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的PfHAP2重組蛋白免疫小鼠后，得到的抗體在標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)中也顯示出強(qiáng)大的TRA(Miuraetal.，2013)效應(yīng)。研究表明，針對保守的HAP2 cd環(huán)肽的抗體在伯氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲系統(tǒng)中均顯示出有效的TRA(Angrisanoetal.，2017) 效應(yīng)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)參與瘧原蟲配子受精過程的II類融合蛋白是TBV的潛在候選抗原。

前期結(jié)果顯示，通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PvHAP2蛋白的抗體表現(xiàn)出了較為明顯的傳播阻斷效應(yīng)，表明PvHAP2具有作為傳播阻斷疫苗候選抗原的潛能。然而，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高昂的代價(jià)明顯不適合大規(guī)模蛋白表達(dá)，在一定程度上制約了其作為疫苗抗原生產(chǎn)系統(tǒng)的可行性。為進(jìn)一步闡明不同表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rPvHAP2蛋白所制備抗體的傳播阻斷活性，本文通過間日瘧原蟲重組rPvHAP2蛋白的原核表達(dá)和抗體血清制備，探討其抗血清對間日瘧原蟲的傳播阻斷活性，結(jié)果證實(shí)了PvHAP2在間日瘧原蟲中的表達(dá)和定位情況，并初步揭示其作為傳播阻斷候選抗原的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用的間日瘧原蟲臨床分離株取自中緬邊境間日疾患者，6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。斯氏按蚊Anophelesstephensi由中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室恒溫飼養(yǎng)。主要試劑辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(HRP-IgG)和鼠抗His-tag單抗購自美國Invitrogen公司，異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、鎳氨三乙酸瓊脂糖柱、肝素鈉及其余常規(guī)化學(xué)試劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。限制性內(nèi)切酶BamH IXhoL I購買自美國NEB公司；血液基因組DNA提取試劑盒選自北京天根生化科技有限公司。DNA純化試劑盒(TaKala Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0)購買于日本TaKala公司。

1.2 目的基因的擴(kuò)增以及原核表達(dá)載體pET32a-PvHAP2的構(gòu)建

為表達(dá)重組蛋白rPvHAP2，在蛋白區(qū)域(231-459 aa)選取了一段229 aa的片段通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。針對表達(dá)的片段以及原核表達(dá)載體 pET32α(+)合理設(shè)計(jì)合成引物PvHAP2-F(5′-caGGATCCGTGCCATCATGGATTTCTCC-3′)和PvHAP2-R(5′-ggCTCGAGAATAATTAACACATTTTTTCA-3′)并在稀釋后用間日瘧原蟲基因組充當(dāng)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系包括 1.5 μL 10 μmol/L引物PvHAP2-F，1.5 μL 10 μmol/L引物PvHAP2-R，5 μL 2 mmol/LdNTPs，5 μL 10×buffer，3 μL 25 mmol/L MgSO4，2 μL DNA模板，1 μL PCR-Plus-Neo，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序如下:先于98 ℃ 預(yù)熱2 min；然后98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)產(chǎn)物的大小切下目的基因片段，并按DNA純化試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的回收。之后用BamH Ι和XhoL I限制性核酸內(nèi)切酶對回收所得的目的基因和原核表達(dá)載體pET32a(+)進(jìn)行雙酶切處理并回收純化，之后用T4 DNA連接酶將回收的片段克隆至原核表達(dá)載體pET32α(+)中。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌DH5α中，采用菌體 PCR 的方法鑒定陽性克隆，并挑取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，在雙酶切鑒定后送北京華大基因測序，用DNA Star軟件進(jìn)行序列比對后，保存菌種備用。

1.3 重組蛋白rPvHAP2的表達(dá)和純化

1.3.1重組蛋白rPvHAP2的表達(dá)：凍存的菌液3 μL接種于3 mL新鮮的LB培養(yǎng)基，加入氨芐抗生素后于 37 ℃下?lián)u菌過夜，次日提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入RGB原核表達(dá)宿主菌中。菌落PCR鑒定正確后，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的300 mL LB培養(yǎng)基，在37 ℃進(jìn)行搖菌,當(dāng)菌液OD值達(dá)到 0.4～0.6 時(shí)，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于19 ℃誘導(dǎo)8 h，10 000 r/min離心10 min收菌。向收集的菌體加入1×Ni-NTA 結(jié)合緩沖液重懸后在冰上進(jìn)行超聲破菌(540 W超聲2 s，間隔3 s，全程時(shí)間20 min),破菌后的菌液在 4 ℃ 條件下12 000 r/min離心5 min，收取上清液樣品。

1.3.2上清蛋白純化：取5 mL 50%鎳氨三乙酸瓊脂糖柱Ni-NTA His·Bind Superflow懸液加入到20 mL 1×Ni-NTA 結(jié)合緩沖液中，輕輕混勻，在3 000 r/min離心5 min，吸去上清，重復(fù)2遍，以激活Ni-瓊脂糖。加入經(jīng)過無菌0.22 μm濾器推濾的20 mL rPvHAP2蛋白表達(dá)后的上清液，在恒溫?fù)u床上輕輕搖動混勻,于4 ℃結(jié)合60 min。加入5倍柱體積的1×Ni-NTA 洗雜緩沖液(含300 mmol/L NaCl與50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.0)在混合器上洗滌10 min，此步驟重復(fù)3～4次。棄去洗雜緩沖液后用10 mL 1×Ni-NTA 洗脫緩沖液(300 mmol/LNaCl與50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.0)進(jìn)行蛋白洗脫，收集蛋白。將洗脫后的蛋白放入透析袋中，并在含咪唑的 PBS 緩沖液中4℃進(jìn)行梯度透析。

1.4 SDS-PAGA電泳和Western blot檢測

將純化后的rPvHAP2蛋白樣品以每孔4 μg進(jìn)行上樣。用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定蛋白的純化情況，濃縮膠在60 V電壓下進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)竭_(dá)分離膠后，將電壓調(diào)到100 V，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色30 min，脫色之后于凝膠成像分析儀上進(jìn)行觀察，從而分析蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化情況。

純化的重組蛋白用10%的SDS-PAGE電泳分離。電泳完畢后，在4 ℃ 45 V恒壓轉(zhuǎn)膜3 h將蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上。以5%(m/V)的TBST(0.1 mol/L TBS, pH 7.4, 0.02% Tween 20)溶解脫脂奶粉在4 ℃封閉2 h。經(jīng)TBST洗3次后，1∶2000稀釋的鼠抗His-tag單抗(5%脫脂奶粉稀釋)與PVDF膜4℃結(jié)合過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(TBST稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL發(fā)光的方法在熒光圖像分析系統(tǒng)中檢測。

1.5 多克隆抗體制備及血清抗體滴度檢測

為了獲得針對重組PvHAP2蛋白的抗血清，用50 μg的上述重組蛋白與弗氏完全佐劑充分混合后通過皮下注射的方式對BALB/c 雌性小鼠進(jìn)行免疫，分別于第3、5周給予兩次加強(qiáng)免疫，免疫方法為25 μg的PvHAP2 重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合后進(jìn)行皮下免疫。于末次免疫后第7 d收集血清檢測抗體滴度。多克隆抗體通過蛋白質(zhì)A柱經(jīng)行收集。用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋重組蛋白rPvHAP2(5 μg/mL)包被96孔酶標(biāo)板，并于4 ℃過夜。經(jīng)200 μL PBST(0.1 mol/L PBS，pH 7.4，0.02% Tween 20)洗板3次后，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉液在37 ℃ 封閉1 h。用PBST 洗3次后，加入用封閉液稀釋的血清(稀釋倍數(shù)從 1∶200 到 1∶25600)，每孔100 μL，于37 ℃孵育2 h。PBST 洗板 3 次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(1∶5000)，37 ℃ 孵育2 h。PBST洗板7次后，加入底物鄰苯二胺和過氧化氫進(jìn)行顯色，100 μL稀H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。

1.6 間接免疫熒光測定(IFA)

在中緬邊境通過顯微鏡鏡檢瘧原蟲的方法招募間日瘧原蟲患者。在獲得書面知情同意(Human Subject Assurance Number：FWA0001184)后，每名患者抽取5 mL靜脈血，并在37℃下立即與2倍體積的懸浮緩沖液(10 mmol/L Tris，pH 7.4，170 mmol/L NaCl，10 mmol/L葡萄糖)進(jìn)行充分混合，以避免雄配子體出絲。離心除去上清液后，將紅細(xì)胞沉淀重懸于10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基中。用47%Nycodenzs/RPMI 1640于500×g離心25 min以對重懸液進(jìn)行分離。收集灰色界面處富含配子體細(xì)胞的組分，并用RPMI 1640洗滌3次。將分離出的配子體細(xì)胞點(diǎn)到多孔載玻片上，并用4%多聚甲醛和0.0075%戊二醛(Sigma)固定30 min。用甘氨酸/PBS(3.75 mg/mL)中和固定液中醛基后，0.1% Triton X-100 透膜10 min。PBS洗滌后，用3%BSA/PBS溶液于37℃封閉30 min。經(jīng)PBS洗滌后，加入抗PvHAP2血清純化的IgG(1∶500)孵育1 h。PBS洗滌后，將玻片與Alexa Fluor?488山羊抗鼠IgG抗體(1∶500)和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)在37℃孵育1 h。PBS洗滌后，將載玻片用ProLong防淬滅試劑盒固定，并使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。免疫前血清用作IFA的陰性對照。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)(SMFA)

在中緬邊境招募間日瘧感染的患者，在知情同意后，每個(gè)患者取10 mL的血液進(jìn)行SMFA以評估抗PvHAP2抗體的傳播阻斷效果。純化的抗PvHAP2的IgG用來自泰國志愿者的AB+人血清(熱滅活去除補(bǔ)體后)以1∶1進(jìn)行稀釋，共180 μL。然后將稀釋的IgG(11.7 μg/μL)樣品與患者的紅細(xì)胞混合(1∶1)，并在37℃孵育15 min后將混勻血液樣品加入膜進(jìn)樣器。每個(gè)樣品，由實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的50只饑餓的按蚊通過進(jìn)樣器進(jìn)食30 min。喂食后，將未進(jìn)食的按蚊去除，吸飽的按蚊飼養(yǎng)于溫度為27℃，80%相對濕度條件下，給予10%蔗糖水。在第7 d每組解剖20只按蚊得到蚊中腸，用0.5%汞色素染色后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)在按蚊中腸上形成的卵囊數(shù)量。對照組用免疫前血清純化的IgG作對照。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析對照組和PvHAP2 免疫組兩組按蚊的卵囊數(shù)之間的差異。Student′st檢驗(yàn)分析ELISA檢測抗體滴度。按蚊感染率的計(jì)算方法為卵囊陽性按蚊在被解剖的全部按蚊中所占的百分比。Fisher′s的精確檢驗(yàn)用于比較對照組和PvHAP2免疫組之間的感染率差異。P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pET32a-PvHAP2重組蛋白的表達(dá)

HAP2/GCS1的結(jié)構(gòu)域具有重要功能，因此，我們選取了PvHAP2的229個(gè)氨基酸片段(231-459 aa)，它包含7個(gè)半胱氨酸但沒有cd環(huán)的結(jié)構(gòu)域。通過PCR的方法成功擴(kuò)增得到了PvHAP2基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoL I進(jìn)行雙酶切后連接至線性化的pET32α載體(圖1)，經(jīng)華大測序正確后，凍菌備用。

圖1 pET32α-PvHAP2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖Fig.1 The protocol for recombinant pET32α-PvHAP2 plasmidA. pET32α原核表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜；B.擴(kuò)增的PvHAP2基因的DNA片段；C.構(gòu)建好的pET32α-PvHAP2原核表達(dá)載體.A. The plasmid map of pET32α prokaryotic expression vector; B. The amplified DNA fragment of PvHAP2 gene; C. The constructed vector of pET32α-PvHAP2.

pET32α-PvHAP2表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，菌體超聲破碎后。使用His-tag鎳氨三乙酸瓊脂糖柱純化重組蛋白，并對洗脫及透析后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測，可清晰看到目標(biāo)蛋白條帶，蛋白純度達(dá)到80%以上。同時(shí)使用Western blot對蛋白進(jìn)行檢測，驗(yàn)證了重組蛋白的正確表達(dá)(圖2)。

圖2 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis and Western blot analysis of purified rPvHAP2 proteinM：蛋白 Marker；Cont：未誘導(dǎo)菌液.M: Protein marker; Cont: Bacterial liquid without induction.

2.2 ELISA檢測血清的抗體滴度

三次免疫后，通過眼球取血獲得免疫后的血清純化IgG。經(jīng)ELISA檢測表明，小鼠對重組PvHAP2蛋白具有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答?？贵w滴度明顯高于對照組，第3次免疫后抗體滴度達(dá)到1∶25600(圖3)。結(jié)果表明，重組PvHAP2具有較好的免疫原性，可誘導(dǎo)雌性BALB/c 小鼠產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答。

圖3 抗PvHAP2 IgG抗體滴度檢測Fig.3 The antibody titer of purified anti-PvHAP2 IgG

2.3 間接免疫熒光檢測蛋白定位

為確定PvHAP2的表達(dá)和定位，在中緬邊境招募間日瘧患者收集血液樣本后，使用密度梯度離心法分離得到間日瘧原蟲配子體進(jìn)行IFA。結(jié)果表明對照組血清與配子體無反應(yīng)，而抗PvHAP2血清可以識別雄性配子體，表明PvHAP2的免疫血清可以識別瘧原蟲天然抗原(圖4)。

圖4 間接免疫熒光檢測PvHAP2在間日瘧原蟲配子體中的表達(dá)Fig.4 Indirect immunofluorescence for PvHAP2 expression in Plasmodium vivax gametocyteBF: 明視野; DAPI: 間日瘧原蟲細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色；FITC: 熒光顯微鏡綠色熒光視野；Merge: DAPI和FITC的合成圖; Control: 免疫前血清分離的IgG(陰性對照).標(biāo)尺為5 μm.BF: Bright field; DAPI: Nucleus stained with DAPI; FITC: gGreen fluorescence; Merge: DAPI+FITC. Control: IgG isolated from pre-immune serum was used as negative control. The scale is 5 μm.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)評估傳播阻斷活性

為了評估抗PvHAP2的抗體是否可以阻斷間日瘧原蟲向按蚊的傳播。將純化的IgG跟志愿者AB+血清混合后再與間日瘧原蟲患者血液混合，進(jìn)行膜飼實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抗PvHAP2抗體表現(xiàn)出了TRA效應(yīng)。與對照血清相比，抗PvHAP2的感染率降低25%，同時(shí)，抗PvHAP2抗體導(dǎo)致平均卵囊數(shù)降低15.3%(圖5, 表1)。

圖5 抗PvHAP2 IgG的傳播阻斷效應(yīng)的評估Fig.5 The transmission blocking effects of purified anti-PvHAP2 IgG

表1 抗PvHAP2 IgG的傳播阻斷效應(yīng)Tab.1 The transmission blocking effect of anti-PvHAP2 IgG

3 討論

傳播阻斷疫苗以瘧原蟲有性階段表面表達(dá)的分子為靶點(diǎn)，通過抑制其在按蚊宿主體內(nèi)發(fā)育進(jìn)而阻止其傳播。目前，傳播阻斷疫苗(TBV)候選抗原主要集中配子和動合子等階段的表面抗原，而對配子期表面抗原的研究較少。盡管配子表面抗原暴露于宿主抗體的時(shí)間相對較短(一般少于1 h)，但配子產(chǎn)生的抗體卻具有很強(qiáng)的TRA(Munesingheetal.，1986)活性。參與受精過程的配子體蛋白(例如P230和P48/45)是表達(dá)在配子表面的具有成為TBV候選抗原潛能的分子靶點(diǎn)。P25和P28是動合子上的主要候選抗原，異源表達(dá)的P25和P28在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可以抑制瘧原蟲在按蚊體內(nèi)的生長發(fā)育(Kaslowetal.，1994, Hisaedaetal.，2000)。然而，在最近的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)即使和EPA進(jìn)行偶聯(lián)，針對Pfs25產(chǎn)生的抗體的存在周期依然比較短，并且只有通過4次免疫后的標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)才有傳播阻斷活性，而直接通過皮膚叮咬則不可以(Sagaraetal.，2018)。目前，間日瘧原蟲的TBV研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于惡性瘧原蟲，這主要是由于缺乏間日瘧原蟲體外培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，大多數(shù)SMFA都是用野外分離株進(jìn)行的。迄今為止，僅對間日瘧原蟲中的少數(shù)TBV候選基因進(jìn)行了研究，并且?guī)缀跛写祟愌芯烤趷盒辕懺x同源蛋白的研究，而兩者的生物學(xué)特性依然有很大差異。間日瘧原蟲的TBV研究集中在Pvs25和Pvs28。在這里，我們的結(jié)果表明，PvHAP2表達(dá)在雄性配子體上，同時(shí)抗血清具有一定的傳播阻斷活性，可以作為間日瘧原蟲TBV的候選抗原。

HAP2是一種在雄性配子中表達(dá)的雄性特異性分子。HAP2具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域II和III參與介導(dǎo)配子膜融合。在結(jié)構(gòu)域II中的有一段～40 aa短肽為融合環(huán)(cd環(huán))(Fédryetal., 2017)。研究表明，針對在大腸桿菌中表達(dá)的重組PbHAP2蛋白(aa 355-609)產(chǎn)生的多克隆抗血清能夠在體外有效抑制伯氏瘧原蟲向動合子轉(zhuǎn)化，并在體內(nèi)抑制卵囊的發(fā)育(Blagboroughetal.，2009)。針對在小麥胚芽無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白PfHAP2(對應(yīng)于PbHAP2片段)產(chǎn)生的多克隆抗血清在SMFA中也顯示出高TRA水平(Miuraetal.，2013)。最近，在PbHAP2和PfHAP2的結(jié)構(gòu)域II中鑒定出cd融合環(huán)，并且針對與載體蛋白耦連后的cd環(huán)的抗體在體外顯示出對動合子轉(zhuǎn)化和按蚊傳播的有效抑制(Angrisanoetal.，2017)。 HAP2是II類融合蛋白，雌雄配子識別結(jié)合的過程，因此抗HAP2抗血清抑制動合子形成可能是通過影響受精過程中膜融合導(dǎo)致的。針對HAP2的抗體也可能通過形成空間障礙而阻止雌、雄配子相互作用。在本實(shí)驗(yàn)中通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了間日瘧原蟲aa 231-459 之間的蛋白。用鎳柱純化重組蛋白后免疫小鼠并純化得到IgG。IFA研究發(fā)現(xiàn)，抗PvHAP2抗體可以有效的識別間日瘧的雄性配子體。同時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)膜飼實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有TRA效應(yīng)，但是阻斷效果不如前期已發(fā)表的桿狀病毒表達(dá)蛋白免疫得到的抗體明顯。本研究中，抗原核表達(dá)蛋白PvHAP2抗體使按蚊感染率降低了25%，平均卵囊數(shù)降低了15.3%?？箺U狀病毒表達(dá)蛋白獲得的PvHAP2抗體使按蚊感染率降低了50%，平均卵囊數(shù)降低了59.07%。我們推測可能原因是由于原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白未能折疊出完全有效的空間結(jié)構(gòu)，蛋白表達(dá)后修飾不足所導(dǎo)致。瘧原蟲基因組特征是阻礙瘧原蟲蛋白表達(dá)的主要原因，包括：(1)瘧原蟲基因組中腺嘌呤和胸腺嘧啶的含量比較高；(2)瘧原蟲具有獨(dú)特的翻譯后修飾。雖然間日瘧原蟲基因組在許多方面與惡性瘧原蟲相似，但間日瘧原蟲在端粒—遠(yuǎn)端區(qū)域富含GC，這些原因?qū)е麓竽c桿菌轉(zhuǎn)錄效率低下，使得瘧原蟲蛋白在非天然宿主中的異源表達(dá)存在蛋白折疊錯(cuò)誤的可能性。

本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)PvHAP2片段包含aa 231-459兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，但是不包括cd環(huán)區(qū)域。通過對不同區(qū)域表達(dá)的蛋白進(jìn)行研究，可以篩選出更有優(yōu)勢的候選抗原表位。在本實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)rPvHAP2具有較好的免疫原性，能夠有效識別出間日瘧原蟲的雄性配子體。但受制于低效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，所得到的抗體傳播阻斷效果不佳。