張義冉 李麗華 黃秀英 劉長清

摘? 要：為了篩選出安全、高效的傳染性喉氣管炎疫苗，指導場區(qū)生產，我公司開展A、B、C、D四種傳染性喉氣管炎活疫苗的疫苗效力檢測、免疫后眼部應激副反應及攻毒試驗等研究。結果顯示，A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結果符合標準;C疫苗不適合雞胚效力試驗。眼部應激反應，C苗應激反應最小，B、D疫苗次之，A疫苗最嚴重。攻毒試驗表明，B疫苗免疫0.5羽份不能完全保護雞群，保護率為90%，其余疫苗均可100%保護雞群。綜合結果表明，C、D兩種傳染性喉氣管炎疫苗免疫0.5羽份效果較好，推薦在該病的流行區(qū)域內使用C、D公司的喉氣管炎疫苗0.5羽份用于發(fā)病群和周邊易感雞群的緊急免疫接種。

關鍵詞：雞傳染性喉炎;喉炎疫苗;免疫效果

中圖分類號：S858.312.5? ? 文獻標識碼：B? ? 文章編號：1673-1085（2021）2-0014-06

雞傳染性喉氣管炎（ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）引起的一種急性、接觸性呼吸道傳染病，臨床表現為伸頸張口呼吸、咳嗽和咳出血樣的滲出物[1]，剖檢癥狀為喉頭、氣管粘膜腫脹、出血和糜爛。本病傳播快，死亡率較高，可引起雞群死亡增加和產蛋下降，嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[2]。

病雞、康復帶毒雞以及病毒污染物是本病的主要傳染源，病毒主要通過呼吸道和眼結膜進行傳播。為了有效控制本病的發(fā)生，本病流行地區(qū)通常選擇雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗進行免疫接種。本病毒只有一個血清型，但不同毒株的致病性和抗原性稍有差異，一些疫苗可造成雞群很大的免疫應激，嚴重影響雞群精神、采食、飲水、體重等各項指標。目前市售的疫苗有多種，但毒力和免疫效果有一定的差異，本試驗通過疫苗效力測定，對雞群分別免疫不同的傳染性喉氣管炎疫苗，觀察免疫后各組雞群的應激性、免疫效果（攻毒保護情況）來進行綜合評估，為臨床生產篩選安全、高效的傳染性喉氣管炎疫苗。

1? 材料與方法

1.1? 試驗雞群? 80只40日齡健康京粉2號雞，隨機分為8個試驗組，每組各10只，每只雞佩戴翅號;20只SPF雞作為陰性及陽性對照，每組各10只，分別飼養(yǎng)于不同的隔離器中。

1.2? 疫苗來源? A、B、C、D四種傳染性喉氣管炎活疫苗，分別來自不同生產廠家。

1.3? 攻毒用毒株? 毒株為2019年山東流行毒株，病毒效價為105.0 EID50/0.1 mL。

1.4? 試驗分組及處理

1.4.1? 疫苗效力檢測? 將各組疫苗用滅菌生理鹽水稀釋成每1.0 mL含5羽份，再繼續(xù)作10倍倍比稀釋，取10-2、10-3、10-4? 3個稀釋度，經絨毛尿囊膜途徑分別接種11日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，每胚0.1 mL。每日照蛋一次，將死胚取出標記死亡時間，放入4 ℃冰箱冷藏，待試驗結束一并進行判定，接種后24 h內死亡的雞胚棄去不計。雞胚絨毛尿囊膜呈明顯增厚、有灰白色病斑時，判為感染，計算EID50，每羽份病毒含量應不低于102.7 EID50。

1.4.2? 雞群分組及免疫? 試驗總共分為10組，其中A、B、C、D? 4個疫苗試驗組，每個疫苗組分2個小組，免疫羽份分別為0.5羽份和1羽份，免疫劑量均為0.1 mL，免疫方法為點眼;2個對照組均不免疫：陽性對照組后期進行攻毒，陰性對照組不做任何處理。

1.4.3? 攻毒保護試驗? 在雞群免疫后27 d（67日齡）進行攻毒保護試驗。攻毒方法：將毒株進行10倍稀釋，試驗組和陽性對照組每只雞進行喉頭滴注法攻毒0.2 mL; 而陰性對照組5只雞，注射毒株稀釋液0.2 mL/只，剩余5只不做任何處理。

1.5? 檢測指標

1.5.1? 免疫后眼部應激副反應? 免疫后10 d，每天觀察雞只的精神狀態(tài)、飲水、采食變化、呼吸道癥狀以及雞的眼睛變化等。根據雞群免疫后的臨床癥狀將病變分為六級，制定相應打分標準：- +：眼部輕微炎癥（0.5分）;+：眼窩周圍腫 （1 分）;++：流淚，眼窩周圍紅腫（2分）;+++：眼窩紅腫嚴重，腫頭（3分）;++++：眼瞼粘連（4分）; +++++：呼吸道癥狀（5分）;對免疫后雞群的應激副反應進行記錄并打分。

1.5.2? 攻毒保護試驗? 喉炎疫苗免疫后27 d，各組每只雞氣管內注射雞傳染性喉氣管炎強毒株0.2 mL（病毒效價為105.0 EID50/0.1 mL），持續(xù)觀察10 d。每天觀察各組雞群眼部變化，記錄死亡剖檢情況，在試驗結束后將全部病料進行PCR檢測。

2? 試驗結果

2.1? 疫苗檢測? 疫苗毒力檢測結果見表1。

由表1可見，全程只有B疫苗以10-2稀釋倍數在接種后96 h雞胚死亡一枚;A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結果分別為103.7 EID50、103.5 EID50和103.3 EID50，均高于國標102.7 EID50，符合標準;C疫苗雞胚效力為101.9 EID50，低于國標，效力檢測不合格。

2.2? 免疫應激反應

2.2.1? 應激反應過程? 各試驗組雞只免后眼部均出現較明顯的應激反應，平均在免后第4天眼部開始有輕微反應，到免后第5天眼瞼粘連最為嚴重，嚴重狀態(tài)維持4 d，免后第9天雞只開始逐漸好轉，到免后14 d基本恢復正常。每組試驗雞具體應激反應情況見表2，應激反應過程見圖1。

2.2.2? 應激反應匯總對比? 將免疫后每組雞群具體的應激反應按照評分標準評分，每組具體評分結果見表3。應激反應合計評分的結果從輕微到嚴重排序為C

2.3? 攻毒保護試驗

2.3.1? 雞群精神狀態(tài)變化? 試驗結果顯示，在免疫組攻毒后第2天，雞只開始出現炸毛、精神沉郁等現象;攻毒后第4天，雞只炸毛現象減輕，B-0.5羽份組雞只死亡1只;攻毒后第5天，雞只狀態(tài)開始好轉;攻毒后第7天，A組疫苗雞只炸毛現象比較嚴重。

陽性對照組雞只在攻毒后24 h內無明顯異常;攻毒后第2天，有的雞只出現精神沉郁、打蔫、炸毛、甩頭等臨床癥狀;攻毒后第3天，隔離器內出現血跡;攻毒后第4天雞只開始有死亡，攻毒后共死亡4只。

2.3.2? 剖檢和實驗室診斷結果

2.3.2.1? 死亡雞只剖檢及PCR檢測結果? 陽性對照組雞只在攻毒后第4、5、6、8天各死亡1只（共4只），B-0.5羽份組在攻毒后第4天死亡1只;陽性對照組雞只死亡前出現典型臨床癥狀，如眼睛流淚、眼瞼腫脹、粘連、伸頸呼吸、咳血等現象。剖檢表現為喉頭、氣管附著粘液和黃色干酪物且容易剝離等變化。雞只臨床癥狀、實驗室診斷結果與傳染性喉氣管炎病理變化和癥狀相符。具體結果見表4和圖2。

2.3.2.2? 未死亡雞只剖檢及PCR檢測結果? 陽性對照組：除個別雞只外，其它雞只剖檢均有明顯的病理變化，如喉頭氣管附著粘液和干酪物、肺病變、脾腫大等，且PCR結果均為陽性。免疫組：雞只無喉炎典型的病理變化，實驗室診斷結果顯示PCR結果均為陰性。

2.4? 綜合試驗結果? 各組試驗結果匯總情況見表5。

結果顯示：疫苗效價評估部分，A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結果符合標準;C疫苗檢測結果不符合標準;免后應激部分，攻毒后眼部應激反應由輕到重的排序為C-0.5羽份

3? 討論

雞傳染性喉氣管炎對我國養(yǎng)禽業(yè)危害較大，該病自從1965年在國內首次報道以來，已在全國范圍內蔓延，發(fā)病例數逐年增加。由于該病的病原雞傳染性喉氣管炎病毒屬于皰疹病毒，能夠在雞體內長期潛伏，受到某些刺激后能夠大量復制并排毒從而引發(fā)疾病，增大了該病防控的難度[3-4]。康復帶毒雞和疫苗接種雞可長期帶毒，并向外界不斷排毒，是主要的傳染源[5]，因此，在疫區(qū)內及受威脅地區(qū)的雞群必須將ILT免疫列入免疫程序，對5周齡以上的雞進行免疫，并做好雞場的隔離和安全防護，非疫區(qū)及5周齡以下雞群免疫應謹慎[6]。

本次試驗的毒株選用的是2019年山東分離的高致病性傳染性喉氣管炎毒株，病毒效價為105.0 EID50/0.1 mL，陽性對照組雞群在攻毒后10 d內共死亡4只，且剖檢病料PCR檢測結果均為陽性，表明該毒株可100%導致雞群發(fā)病。

疫苗效力檢測結果顯示，A、B、D疫苗雞胚接種效力檢測結果均高于國標102.7 EID50，符合標準;C疫苗雞胚效力檢測不合格，但C為細胞苗，不適合雞胚效力檢測。

目前對 ILTV 最有效的預防方法還是疫苗接種，其中點眼是最好的免疫方法[7]。現有傳染性喉氣管炎疫苗一般是減毒疫苗，但也會表現出減毒不完全，往往接種疫苗后表現一定的病理損傷（如產生不同程度的眼結膜炎，一般1～2周后恢復）[8]。劉興彩[9]研究表明在使用傳染性喉氣管炎疫苗1羽份以下的免疫劑量進行免疫時，雞群的免疫副反應相對較小，而且雞群在 5 d內即可恢復;但本研究數據表明，整體來看，A、B、C、D疫苗0.5羽份和1羽份組雞群平均在免后第4天開始有輕微反應，到免后第5天眼瞼粘連最為嚴重，嚴重癥狀維持4 d左右，免后第9天雞只開始逐漸好轉，到免后14 d雞只基本恢復正常。各試驗組應激反應由輕到重排序為C-0.5羽份

本研究攻毒保護試驗結果顯示，攻毒10 d后，陽性對照組雞群死亡4只，且病料PCR檢測結果均為陽性，B-0.5羽份疫苗免疫組于攻毒后第4天死亡1只，且病料PCR檢測結果為陽性，其余組別無死亡，表明B疫苗免疫0.5羽份不能完全保護雞群，保護率為90%;其余疫苗均可100%保護雞群。劉興彩[9]喉炎免疫攻毒試驗研究結果表明，0.2 羽份以上的免疫劑量可對雞群產生較好的保護力，但隨著免疫劑量的增大，免疫反應逐漸加重，因此結合本試驗結果建議每只雞進行傳染性喉氣管炎疫苗免疫時可應用 0.5 羽份的劑量。

從喉炎疫苗的效力檢測、疫苗免疫后的應激反應到攻毒后的免疫保護試驗結果顯示，C、D兩種傳染性喉氣管炎疫苗免疫0.5羽份效果較好，推薦在該病的流行區(qū)域內使用C、D公司的喉氣管炎疫苗0.5羽份，以用于發(fā)病群和周邊易感雞群的緊急免疫接種。

參考文獻：

[1]? 呂榮修.禽病診斷彩色圖譜[M].北京：中國農業(yè)大學出版社，2004：128.

[2]? Irit Davidson，Sagit Nagar，Israel Ribshtein. Detection of Wildand Vaccine -Type Avian Infectious Laryngotracheitis Virus in Clinical Samples and Feather Shafts of Commercial Chickens[J].American Association of Avian Pathologists.2009， 53（4）：618- 623.

[3]? 陳永軍.雞傳染性喉氣管炎的流行病學、癥狀、診斷和防控[J].當代畜牧科技， 2018（4）：115.

[4]? 冷秋仙，王群義，劉紅祥，等.雞傳染性喉氣管炎流行新特點及防控措施[J].家禽科學，2016（2）：44-45.

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[6]? 張洪輝，曹守林，李寧，等.雞傳染性喉氣管炎的研究進展[J].中國家禽，2012，2（02）：57-61.

[7]? 鄭德富，李平.雞傳喉疫苗的正確使用[J].畜禽業(yè)，2003（4）：63.

[8]? 吳孔興，陳峰，張秀麗，等.兩種不同傳染性喉氣管炎疫苗應用的比較試驗[J].中國禽業(yè)導刊，2005，22（2）：33.

[9]? 劉興彩，鄒立宏，張力青，等.雞傳染性喉氣管炎凍干苗（喉必妥）免疫保護試驗[J].獸醫(yī)導刊，2011（12）：72-74.

[10]? 辜新貴，賴柏松，吳小春，等.五種雞傳染性喉氣管炎疫苗免疫副反應的綜合評估[J].中國家禽，2012，34（10）：48-50.

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