羅文學(xué),阿依木古麗,韓郁茹

(1.天?？h畜牧技術(shù)推廣站，甘肅 天祝733299，2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院)

1 Fas基因與fasl的關(guān)系

Fas基因，又稱APO-1、CD95，最早在90年代被遷本(Tsujitomo)發(fā)現(xiàn)的促細胞凋亡因子。Fas基因是由編碼325個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，為腫瘤壞死基因超家族的成員(TNF-6)。Fas是一種分子質(zhì)量約為48 ku的I型跨膜蛋白，廣泛分布于人和動物機體的各組織中。

FasL，即Fas配體，是Ⅱ跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量約為40 ku。Fas和FasL二者在淋巴細胞的生長、發(fā)育、成熟、分化和免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用。當Fas與FasL結(jié)合后，將導(dǎo)致Fas發(fā)生寡聚反應(yīng)，進而引起細胞內(nèi)死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)的組裝，該復(fù)合體通過激活起始caspase引發(fā)一系列有關(guān)酶的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致Fas細胞凋亡。目前研究表明Fas和FasL通過介導(dǎo)細胞凋亡在腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病和感染性疾病等中起著重要的調(diào)控作用。研究表明卵泡閉鎖發(fā)生于卵泡發(fā)育的任何時間內(nèi)，并且逐步進行，多是相鄰囊狀較小的卵泡先發(fā)生閉鎖。Fas作為細胞凋亡基因，探究其在卵巢不同發(fā)情周期中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，通過熒光定量RT-PCR技術(shù)進行生物學(xué)信息分析，為天祝白牦牛卵巢閉鎖系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗對象

本實驗以健康天祝白牦牛的母牦牛作為實驗對象。分別屠宰處于卵泡期、懷(10～30 d)、懷孕(40～60 d)、懷孕(70～90 d)、黃體期、乏情期的健康母牦牛，用無菌手術(shù)剪采集卵巢，用液氮保存并帶回實驗室進行mRNA熒光定量分析實驗。

2.2 實驗試劑與實驗器材

實驗試劑：TRIZOL試劑、M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒(試劑盒組分①5×Reaction Buffer②dNTP Mix(10mmol/L)③Oligo dT Primer(0.5μg/μL)④Random Primer p(dN)6(0.2μg/μL)⑤Rnase lnhibitor(20U/μL)⑥M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μL)(生工生物工程(上海)股份有限公司)⑦Rnase -free ddH2O)、 氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase-free ddH2O、瓊脂糖、1×TAE、核酸染料。

實驗器材：臺式高速冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋、立式高溫壓力滅菌器、電子秤、電泳系統(tǒng)、凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)、電泳槽、雙人單面循環(huán)凈化工作臺、超低溫冰箱、基因擴增儀、移液槍、高壓滅菌后的槍頭、離心管、渦旋振蕩器、PCR管、酒精燈、鑷子、制冰機、電泳槽、錐形瓶、量筒等。

2.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

將研缽及研缽棒等器材用洗潔精洗凈后用蒸餾水沖洗干凈，晾干并放入電熱恒溫干燥箱中280℃、30 min，以除去研缽中的細菌等污染物。此外實驗過程中所用到的移液槍槍頭、離心管以及PCR管均需于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、20 min滅菌。當溫度降至室溫以后，取出實驗器材并晾干備用。

2.3.1 根據(jù)Trizol提取試劑法的說明書步驟進行操作 (1)將所需要的實驗器材和在-70℃冰箱中液氮保存的牦牛子宮組織，放置于超凈工作臺中。打開紫外燈將超凈工作臺紫外殺菌15 min然后打開吹風機再用燃燒的酒精棉球消毒臺面。雙手及袖子噴灑酒精消毒后進入工作區(qū)域，將酒精棉球點燃后用鑷子夾住，然后擦拭研缽以及缽棒，用以消毒研缽及缽棒。(2)待研缽表面溫度與室溫相同時，取適量液氮于研缽中，再取樣品組織于研缽中，用缽棒迅速研磨。在研磨期間需不斷補充液氮，直至組織研磨成白色的粉末狀并轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。(3)經(jīng)液氮研磨后的卵巢組織按50～100 mg組織/mL Trizol提取試劑加入Trizol提取試劑后，室溫放置5 min，加200 μL氯仿，劇烈震蕩15 s，轉(zhuǎn)移至離心管。將離心管放入臺式高速冷凍離心機中，12 000 rmp/min，4℃，10 min。(4)取上層清液加入等體積異丙醇，室溫靜置20 min。再轉(zhuǎn)入臺式高速冷凍離心機，12 000 rmp/min，4℃，10 min。(5)棄去上清液，加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀。再離心，12 000 rmp/min，4℃，3 min。(6)棄去上清液后，室溫干燥5～10 min。(7)對沉淀進行濃度檢測，即采用無RNA酶的DNase Ⅰ(可加入適量加入適量RNA酶抑制劑)處理提取RNA中夾帶的DNA。具體操作如下表1所示：將混合物混勻，37℃放置90 min。(8)配制1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠，取(9)中的混合物4 μL，加入加入6×RNA電泳上樣緩沖液2 μL混勻，緩沖液2 μL混勻，再加入電泳槽加樣孔中。120 V，25 min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。電泳條帶可見28S和18S兩條明亮條帶，則無DNA條帶污染。加入30～50 μL RNase-free ddH2O將所得RNA溶解并置于-70℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 RNA濃度檢測反應(yīng)體系

2.3.2 根據(jù)生工生物工程(上海)股份有限公司的M-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μL)的說明書進行操作 (將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA) (1)反應(yīng)需在冰浴中進行。檢查5* Reaction Buffer是否有結(jié)晶出現(xiàn)。在無結(jié)晶的情況下繼續(xù)進行如下操作。向試管總分別加入表2中反應(yīng)物，試劑加入完畢后，用手輕輕混勻，并離心3～5 s。(2)反應(yīng)混合物在65℃水浴中放置5 min， 然后在試管冰浴的過程中加入如表3中組分，輕輕混勻并離心3～5 s：(3)接著按如下表操作在PCR儀上進行反轉(zhuǎn)錄：再冰浴30 s，接著離心3～5 s，冰浴。(4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色后再紫外染色。結(jié)果呈現(xiàn)出200～10 kb的拖帶，則其中心區(qū)域在1～4 kb之間，cDNA反轉(zhuǎn)錄結(jié)果安全。將產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物

表3 反轉(zhuǎn)錄試劑

表4 cDNA的合成

2.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中牦牛(Bos grunniens)β-action(GeneBank登錄號：DQ838049.1)、牦牛Fas(GeneBank登錄號：JN880421.1)和牦牛FasL(GeneBank登錄號：JN880420.1)基因的mRNA序列，采用Primer Primer5.0軟件對目的基因進行PCR引物設(shè)計并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過β-action作為內(nèi)參基因來檢測天祝白牦牛發(fā)情周期不同階段卵巢Fas的表達變化。引物信息如表5。

表5 引物序列與Real-time PCR反應(yīng)參數(shù)

引物序列及反應(yīng)條件

2.5 目的基因熒光定量與RT-PCR擴增

熒光定量RT-PR反應(yīng)體系(25μL)根據(jù)SYBR Premax Tag進行操作，反應(yīng)體系的配制如下。

表6 熒光定量RT-PR反應(yīng)體系

熒光定量RT-PR反應(yīng)程序：預(yù)變性95.0℃、5 min，變性95.0℃、30 s，退火60℃(Fas)/60℃(FasL)/60℃(β-action)、20 s，延伸72.0℃、30 s，循環(huán)40次。分別在每個循環(huán)的退火和延伸階段采集熒光信號數(shù)據(jù)。待擴增結(jié)束后即進行溶解曲線分析，根據(jù)所得的溶解曲線判斷反應(yīng)的特異性。再根據(jù)每個樣品的Ct值，用2-ΔΔCt法計算出目的基因的相對表達量。

2.6 數(shù)據(jù)分析

每個實驗樣品需重復(fù)3次。系統(tǒng)根據(jù)實時熒光定量RT-PR反應(yīng)結(jié)果得出的溶解曲線計算出各個樣品中目的基因和內(nèi)參基因含量的含量，并以同一樣品中目標基因的相對和內(nèi)參基因含量的比值作為目標基因的相對表達量。所得出的實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件One-way ANOVA進行方差分析以及顯著性檢驗。結(jié)果用平均值、標準差表示，P<0.05時表明差異顯著，P>0.05時表明差異顯著。

3 結(jié)果

如圖1所示：Fas的表達含量在黃體期最高，其次為卵泡期。懷孕中期Fas表達含量很少，幾乎不表達。

圖1 Fas的表達含量

如圖2所示：FasL的表達含量在黃體期最高，其次為卵泡期。懷孕中后期FasL表達含量較少，但相對于Fas表達量較多。

圖2 Fasl的表達含量

4 討論

天祝白牦牛卵巢主要位于子宮闊韌帶前部的卵巢系膜邊緣處，為卵圓形的實質(zhì)性器官。卵巢其形如黃豆，且卵巢門無凹陷。卵巢可分為外周的皮質(zhì)和中央的髓質(zhì)。皮質(zhì)是卵泡發(fā)育的場所，故內(nèi)含有不同發(fā)育階段的卵泡。而髓質(zhì)中含有豐富的血管和結(jié)締組織，為卵泡的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。卵泡的生長發(fā)育過程可分為原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡。在多數(shù)情況下，最終能發(fā)育到成熟且進入排卵階段的卵泡在整個卵泡發(fā)育體系中只占極少數(shù)。卵泡排卵后，卵泡壁塌陷，一方面卵泡壁內(nèi)膜上的血管破裂出血形成紅體，另一方面殘留于卵泡內(nèi)的顆粒細胞和內(nèi)膜細胞分別形成粒性黃體細胞、膜性黃體細胞，二者均具有分泌功能，分別分泌孕酮和雌激素。卵巢作為內(nèi)分泌腺，在卵泡期伴隨卵泡的發(fā)育，雌激素的合成與分泌逐漸增加，其在血液中的濃度逐漸上升，而孕激素相對處于較低水平。排卵后，隨著黃體的生成，血液中雌激素濃度下降，而孕激素含量顯著升高。在卵泡生長發(fā)育過程中，F(xiàn)SH和LH為其主要的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子，它們通過與受體結(jié)合激活cAMP依賴性生理過程，進而促進了粒細胞和壁細胞類固醇激素生成酶的活性，血液和卵泡液中E2的濃度也隨之升高。此外卵泡細胞還可生成抑制素、催產(chǎn)素、松弛素活化素等，參與卵泡生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。在自然條件下，多數(shù)卵泡都會隨著發(fā)育的進行逐漸退化成為閉鎖卵泡，而僅剩余的少數(shù)卵泡為優(yōu)勢卵泡。

在天祝白牦牛妊娠早期，其卵巢可分泌顆粒且分泌顆?？赏ㄟ^胞吐作用釋放到卵泡細胞中調(diào)節(jié)卵泡細胞的生長發(fā)育，并與早期妊娠密切相關(guān)。伴隨著發(fā)情周期的延續(xù)，卵巢發(fā)生周期性的變化。實驗結(jié)果表明，卵泡期、懷孕期10～90 d、黃體期以及乏情期過程中Fas和FasL均有表達。其中，F(xiàn)as在黃體期mRNA相對表達含量最高，其次為卵泡期，在懷孕期間Fas的mRNA幾乎不表達，之后在乏情期含量顯著上升。FasL在黃體期的mRNA相對表達含量最高，在卵泡期的表達量也較高，再次為乏情期和懷孕(10～30 d)，懷孕(40～90 d)mRNA相對表達含量相對較少。但總體來說，天祝白牦牛不同發(fā)情周期卵巢FasL的mRNA相對表達含量相對Fas含量較高。表明，F(xiàn)as和FasL凋亡通路參與調(diào)節(jié)牦牛卵泡細胞周期性的增值與調(diào)節(jié)過程，而且在其凋亡途徑中主要通過Fas的調(diào)控來實現(xiàn)。研究表明子宮內(nèi)膜雌激素受體αmRNA和孕激素受體mRNA在發(fā)情周期后期相對表達含量最強、間情期相對表達含量最弱，雌激素可以降低牦牛子宮內(nèi)膜細胞中Fas及FasL的表達。本試驗中在黃體期Fas和FasL表達顯著上升，此時血清雌激素水平降低。研究發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜中ERαRNA和蛋白質(zhì)都在卵泡期隨著血清雌激素水平升高而極顯著增加，雌激素可以上調(diào)其受體ERα的表達。此外，卵巢的卵泡閉鎖在黃體期細胞凋亡顯著升高，乏情期卵巢凋亡蛋白相關(guān)基因表達量降低，而在發(fā)情間期凋亡蛋白幾乎不表達。

5 結(jié)論

天祝白牦牛不同發(fā)周期卵巢中，F(xiàn)as的相對表達含量在黃體期最高，懷孕期間幾乎不表達；FasL的相對表達含量在黃體期表達最高，而在卵泡期，懷孕期間相對表達含量逐漸降低，但表達量高于Fas。