劉瑞芳,陳嘉軒,李艾欣,孫 喜,呂 立

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

所謂細(xì)胞融合就是指在外力(誘導(dǎo)劑或促融劑)的作用下，2個(gè)或2個(gè)以上的異源細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象，又稱細(xì)胞雜交。體外誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有物理法、化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法是利用化學(xué)試劑如聚乙二醇、二甲基亞砜、脂質(zhì)體等改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子排列誘導(dǎo)細(xì)胞融合。PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合受很多因素的影響,如細(xì)胞密度、PEG相對(duì)分子質(zhì)量、PEG的體積分?jǐn)?shù)等。該試驗(yàn)以雞紅血細(xì)胞為材料,通過(guò)調(diào)整雞紅細(xì)胞保存液和pH,詣在提高細(xì)胞融合率，為PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合在本?？茖?shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 GKN溶液、1%Hanks溶液、50% PEG溶液、抗凝劑、阿氏液(Alsver)、0.85%生理鹽水、1%詹那斯綠B溶液。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 分析天平(日本島津有限公司)、低速離心機(jī)(湖南湘儀有限公司)、移液器(德國(guó)eppendorf有限公司)、恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、光學(xué)顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)

2 試驗(yàn)方法

2.1 血細(xì)胞懸液的制備

2.1.1 使用Alsver液制備血細(xì)胞懸液 雞翅下靜脈采血，將采集的血液注入含有檸檬酸鈉的Alsver液中，Alsver液與雞血按1︰3～1︰4的比例稀釋，制成雞血紅細(xì)胞儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液1 mL，加入4 mL 0.85 %的生理鹽水，混勻，1 500 rpm離心5 min, 棄上清液，重復(fù)上述操作一次。所得沉淀用4 mL GKN溶液1 000 rpm離心3 min, 棄上清液，再用GKN溶液稀釋沉淀，制成血細(xì)胞懸液。

2.1.2 使用生理鹽水制備血細(xì)胞懸液 在肝素鈉抗凝采血管中用靜脈采血針采血 2～4 mL，輕輕顛倒采血管使血液充分與肝素接觸。取 0.5 mL抗凝全血與4.5 mL 0.85%的生理鹽水，混勻，1 500 rpm 離心 3 min，棄上清；再重復(fù)此步驟一次。所得沉淀用4.5 mL Hanks溶液1 000 rpm離心3 min, 棄上清液，再用Hanks溶液稀釋沉淀，制成血細(xì)胞懸液。

2.2 PEG誘導(dǎo)血細(xì)胞的融合

取1 mL上述細(xì)胞懸液于離心管中，加入0.5 mL預(yù)熱的50% PEG(Mr=4000)溶液， 39℃水浴中進(jìn)行10 min的細(xì)胞融合。然后再加入GKN溶液終止細(xì)胞融合，每個(gè)水平5個(gè)重復(fù)。

2.3 血細(xì)胞染色及鏡檢

托底輕搖后，取1小滴懸液于載玻片上，加少量的詹那斯綠B染液，染色5 min左右，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合的情況并計(jì)數(shù)細(xì)胞融合率。

2.4 計(jì)算細(xì)胞融合率

隨機(jī)選取鏡下視野，在每個(gè)視野下讀取已融合和未融合的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞融合率。即：細(xì)胞融合率 = 已融合細(xì)胞核數(shù) / 總細(xì)胞核數(shù)×100 %。

2.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)水平設(shè) 5 個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行單因素方差分析和雙因素方差分析，以P<0.05 為差異顯著，P>0.05為差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同血細(xì)胞保存方法對(duì)細(xì)胞融合率的影響

從表1中發(fā)現(xiàn)，利用肝素鈉抗凝采血管抗凝后的雞全血經(jīng)0.85%生理鹽水處理后，在4℃冰箱保存1周后，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核清晰，形態(tài)規(guī)則，穩(wěn)定性良好，細(xì)胞的融合率穩(wěn)定，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的融合率沒(méi)有明顯變化。而使用Alsver液處理的血細(xì)胞，保存時(shí)間不超過(guò)24 h，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的融合率明顯降低。

表1 不同血細(xì)胞保存方法對(duì)細(xì)胞融合率的影響

3.2 不同pH對(duì)細(xì)胞融合率的影響

從表2可看出， 隨著pH值的改變，細(xì)胞融合率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。pH為8時(shí)細(xì)胞融合率顯著高于pH為6.5、8.5和9.0(P<0.05)，與pH值為7.0和7.5時(shí)細(xì)胞融合率差異不顯著(P>0.05)，即pH值為6.5的酸性條件下，細(xì)胞的融合率最低，而pH為8時(shí)細(xì)胞的融合率最高。

4 討論

4.1 不同血細(xì)胞保存方法對(duì)細(xì)胞融合率的影響

Alsever液主要由檸檬酸鈉、檸檬酸、氯化鈉和葡萄糖組成，具有一定的抗凝血作用，也是一種等滲平衡的血細(xì)胞保存液?？鼓齽┑囊恍┏煞峙c血液中的Ca2+形成難解離的可溶性絡(luò)合物，勢(shì)必導(dǎo)致血液中的Ca2+濃度降低。大量研究表明，血液中高Ca2+能夠促進(jìn)和提高細(xì)胞融合率。本實(shí)驗(yàn)使用Alsever液制備血細(xì)胞懸液組的細(xì)胞融合率顯著低于肝素鈉制備組，與前人的研究結(jié)果一致，可能是Alsever液的抗凝血作用直接導(dǎo)致Ca2+濃度降低，從而造成細(xì)胞融合率下降所致。生理鹽水處理組更有利于延長(zhǎng)血細(xì)胞的保存時(shí)間，且不影響血細(xì)胞的融合率。

4.2 不同pH對(duì)細(xì)胞融合率的影響

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH 是影響細(xì)胞融合率的關(guān)鍵因素之一，這與前人的研究結(jié)果一致。偏酸性條件下融合效率較低，當(dāng) pH=7～8時(shí)，細(xì)胞融合率有明顯升高的趨勢(shì)，說(shuō)明弱堿性環(huán)境可促進(jìn)細(xì)胞聚集接觸、引起磷脂雙分子層疏松重排，提高細(xì)胞的融合率?？赡茉蛞豢赡苁?pH對(duì) PEG 活性產(chǎn)生了影響，原因二可能是 pH 對(duì)融合細(xì)胞自身產(chǎn)生了影響。當(dāng)pH=8.5～9.0時(shí)細(xì)胞的融合率又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明強(qiáng)堿性條件不利于細(xì)胞融合。

5 結(jié)論

在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，選擇適宜觀察的有核紅細(xì)胞、便于操作的 50%濃度 的PEG為實(shí)驗(yàn)材料；利用肝素類抗凝管采集血液，且 4℃保存細(xì)胞穩(wěn)定性好；全血與洗滌液和緩沖試劑按 1∶10 比例、pH為 8.0時(shí)進(jìn)行融合的細(xì)胞融合率最高。