趙 洋，張 欣，夏雨婷，趙瑞利,*，李 穎，張振洲，于恩遠(yuǎn)，曾 君, 張湟溆，劉湘荃

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384; 2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)屬于一種革蘭陽(yáng)性菌，能在體內(nèi)產(chǎn)生α毒素、腸毒素、血漿凝固酶、酚溶解蛋白等多種毒力因子，能引起人和動(dòng)物的各種感染性疾病。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)隨著內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的大量使用而進(jìn)一步增加。研究表明，金黃色葡萄球菌形成的生物被膜，它們是促進(jìn)細(xì)菌耐藥性的重要原因。

生物被膜是指一種微生物為了適應(yīng)其周?chē)h(huán)境，黏附于介質(zhì)的表面，并被其自身分泌的胞外基質(zhì)(Extracellular polymericsubstances，EPS)包裹而形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其形成與周?chē)h(huán)境及自身基因調(diào)控有關(guān)。生物被膜內(nèi)的各種細(xì)菌對(duì)抗菌藥物和宿主免疫系統(tǒng)具有非常強(qiáng)的耐藥性，通過(guò)抗菌藥物治療很難將其完全消滅或消除，若增加抗生素用量，不但不能殺滅被膜內(nèi)細(xì)菌，還可能會(huì)引起毒副作用。因此尋找新的作用于生物被膜形成的生物活性物質(zhì)成為研究的熱點(diǎn)，本試驗(yàn)利用已改造的嵌合體肽，研究對(duì)金黃色葡萄球菌的黏附及其生物被膜形成的抑制作用，為防控生物被膜耐藥菌以及新型抗生物被膜菌的抗菌藥物提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 抗菌肽樣品

抗菌肽樣品由浙江鴻拓生物技術(shù)有限公司采用固相合成法(SPPS)合成。通過(guò)HPL.C(Waters 600 controller)反相C18柱層析脫鹽、純化,利用快原子轟擊質(zhì)譜法(AB3200)來(lái)測(cè)定分子質(zhì)量,其純度≥95%?？咕男蛄行畔⒁?jiàn)表1。

表1 抗菌肽序列

1.2 主要試劑

使用試劑見(jiàn)下表2。

表2 試劑名稱(chēng)及生產(chǎn)廠家

1.3 主要儀器

使用的主要儀器見(jiàn)表3。

表3 儀器名稱(chēng)及生產(chǎn)廠家

2 方法

2.1 金黃色葡萄球菌的分離培養(yǎng)

將金黃色葡萄球菌分別接種于MH、血瓊脂、麥康凱、伊紅-美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并進(jìn)行染色鏡檢。

2.2 革蘭氏染色

用95%的酒精擦洗蓋玻片，保證蓋玻片無(wú)菌，在每一張載玻片上分別滴1～2 滴生理鹽水，用接種環(huán)輕輕挑取單一菌落溶解到生理鹽水中，在一盞酒精燈上烘焙晾干，用移液管在每一張載玻片中央分別滴入適量結(jié)晶紫染液，染色 1 min 后緩慢進(jìn)行沖洗。用移液管將適量碘液滴到載玻片上，染色1 min后進(jìn)行沖洗。再用移液管吸取適量無(wú)水乙醇脫色 30 s 左右，時(shí)間一般不能太久，直至流出的乙醇不會(huì)顯示紫色為止，隨即緩慢地進(jìn)行沖水。用移液管吸取適量復(fù)紅染液染色 30 s，隨即進(jìn)行沖水，注意以上沖水不能直接沖洗細(xì)菌。用濾紙輕輕按壓吸干載玻片上面的水分，向載玻片上滴1～2滴香柏油，放置顯微鏡下用油鏡觀察。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定，取4個(gè)或5個(gè)分離純化后的菌落，制成菌懸液。將已經(jīng)稀釋的菌液均勻接種于MH培養(yǎng)基上，選用目前在國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床上較為常見(jiàn)的19種藥敏紙片(隸屬杭州微生物試劑有限公司)，用無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片均勻貼在培養(yǎng)基表面，每片間距一般間隔3 cm左右，37℃連續(xù)培養(yǎng)24 h后即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察并獲得觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑大小。參考藥物抑菌圈的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)基本可以判定對(duì)其藥物敏感性。

2.4 細(xì)菌鑒定及生物被膜相關(guān)基因鑒定

2.4.1 DNA提取 挑取菌落放入離心管中，100℃煮沸 20 min，離心取上清 5 μL 作為DNA模板。

2.4.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 根據(jù)一個(gè)金黃色葡萄球菌的基因序列設(shè)計(jì)出特異性基因(nuc)及生物被膜主要基因(icaA，fib)的PCR引物。

根據(jù)合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：DNA模板5μL，l0×Buffer2.5 μL，dNTP2 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，用ddH20補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸35 s，共35個(gè)循環(huán)；然后72℃終延伸10 min。測(cè)序并進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，引物信息見(jiàn)表4。

表4 引物信息

2.5 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜胞蛋白的影響

2.5.1 蛋白提取 培養(yǎng)生物被膜及收集上清液，吸取20 μL樣品于96孔板中，再依次加入200 μL的G-250染料，室溫下靜止放置5 min后使用酶標(biāo)儀在595 nm 處測(cè)定吸光度值。

2.5.2 BCA 蛋白濃度測(cè)定 按照 BCA蛋白濃度試劑盒制備標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定生物被膜胞外蛋白含量。(1)BCA工作液配置:根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，以BCA試劑: Cu試劑=50∶1的比例(體積比)進(jìn)行配置；(2)稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品:取 BSA標(biāo)準(zhǔn)品15 μL，加入 135 μL PBS稀釋?zhuān)靹蚝髠溆茫?3)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品:分別取標(biāo)準(zhǔn)品0 μL,2 μL,4μL,6 μL,8 μL,12 μL,16 μL,20 μL,加入96孔板中，每孔加 PBS溶液至20 μL,每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔；(4)樣品稀釋:取5 μL待測(cè)樣品，加PBS 溶液至20 μL，每種樣品設(shè)置2個(gè)平行對(duì)照；(5)分別將各孔中加入200 μLBCA工作液，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min；(6)用酶標(biāo)儀測(cè)定 A560 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。

2.6 掃描電鏡觀察抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的影響

向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次放入細(xì)胞爬片，每孔分別加入1%葡萄糖的TSB4 mL，按照1∶100比例依次分別加入經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)的菌液和含T-La(FS)、RGD-T-La(FS)、T-La(S)、RGD-T-La(S)的4MIC的金黃色葡萄球菌菌懸液，放于37 ℃培養(yǎng)箱中持續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)72 h。將樣品使用無(wú)菌PBS(pH為7.4)清洗2次來(lái)除去樣品中的浮游細(xì)菌，15 min/次；然后用2.5%電鏡專(zhuān)用固定液在4 ℃條件情況下固定24 h后，用無(wú)菌PBS(pH為7.4)漂洗3次，分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%不同梯度的乙醇脫水1次，15 min/次；再用無(wú)水乙醇脫水2次，20 min/次；然后進(jìn)行真空干燥，對(duì)整個(gè)樣品進(jìn)行噴金后再次使用掃描電鏡觀察樣品。

2.7 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

將金黃色葡萄球菌生物被膜培養(yǎng)至成熟期，于96孔板中依次分別加入含有1%葡萄糖的TSB菌懸液100 μL，然后依次分別加入終濃度為4 MIC的T-La(S)、RGD-T-La(S)、T-La(FS)、RGD-T-La(FS)，每孔依次分別加入100 μL，陰性對(duì)照組加200 μL菌懸液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃孵育24 h。采用Trizol法，利用RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，兩個(gè)生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量，熒光定量的PCR反應(yīng)體系參照UltraSYBR Mixture說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 結(jié)果分析

3.1 金葡菌的分離培養(yǎng)

細(xì)菌在MH培養(yǎng)基中均勻地混合生長(zhǎng)，形成一些不透明的白色菌落；血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出微型菌落，呈現(xiàn)淡灰色，透明狀，圓形，凸起，光滑，邊緣規(guī)則，露珠狀，產(chǎn)生β溶血；未見(jiàn)在麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。(結(jié)果見(jiàn)圖1)

A. MH培養(yǎng)基 B. 血瓊脂培養(yǎng)基

3.2 革蘭氏染色結(jié)果

革蘭氏染色結(jié)果顯示見(jiàn)圖 2，分離得到的菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，球形，排列為葡萄串狀，初步認(rèn)定為葡萄球菌。

圖2 革蘭染色鏡檢結(jié)果

3.3 藥敏試驗(yàn)

各種藥物的抑菌圈直徑與其標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照得出以下結(jié)果，見(jiàn)表5，本實(shí)驗(yàn)分離的金黃色葡萄球菌對(duì)多西環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢氨芐、羧芐西林、頭孢曲松、頭孢他啶、紅霉素、米諾環(huán)素、青霉素、西環(huán)素、頭孢拉定、頭孢哌酮、頭孢呋辛、哌拉西林耐藥，對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、丁胺卡那處于中介。

表5 金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)判定結(jié)果與判定標(biāo)準(zhǔn) mm

續(xù)表5

3.4 金黃色葡萄球菌16S rRNA、特異性基因及生物被膜相關(guān)基因PCR檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增的16S rRNA基因大小約為1 500 bp。耐熱核酸酶基因nuc被特異性擴(kuò)增，出現(xiàn)大小為270 bp的條帶，與目標(biāo)產(chǎn)物的大小一樣。icaA基因和fib基因PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，條帶大小分別約為178 bp和239 bp。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.5 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜胞外蛋白含量的影響

測(cè)定抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的生物被膜中胞外蛋白含量的影響，由圖4可知，隨著抗菌肽濃度的增加，對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜胞外蛋白的抑制率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。4種多肽(T-La(S)、RGD-T-La(S)、T-La(FS)和 RGD-T-La(FS))在4MIC濃度時(shí)，抑制的比率分別為31.44%、39.62%、70.52%和51.87%; T-La(FS)對(duì)生物被膜胞外多糖抑制率顯著或極顯著高于T-La(S)、RGD-T-La(S)和RGD-T-La(FS)(P<0.05;P<0.01)，以 T-La(FS)的抑制效果最為顯著。表明抗菌肽主要抑制金黃色葡萄球菌生物被膜胞外蛋白合成與分泌，阻斷胞外聚合物的大量產(chǎn)生，降低金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。

圖4 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜胞外蛋白含量的影響

3.6 掃描電鏡觀察抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的影響

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，對(duì)照組的細(xì)菌呈球形、結(jié)塊狀，可以看到細(xì)菌之間存在黏液，且其表面有大量的絲狀黏液，即菌體所分泌的大量胞外物質(zhì)，少數(shù)細(xì)菌未被完全包裹，仍能清楚地看到附著的單個(gè)球狀菌體，圖中可以明顯的看出隨著多肽的加入其菌體的黏附性降低，與對(duì)照組相比加入T-La(FS)的菌體黏附性最低，其次為RGD-T-La(FS)、T-La(S)，相對(duì)來(lái)說(shuō)RGD-T-La(S)的黏附性最高。

圖5 生物被膜掃描電鏡觀察結(jié)果

續(xù)圖5 生物被膜掃描電鏡觀察結(jié)果

3.7 抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，RGD-T-La(S)、T-La(FS)、RGD-T-La(FS)對(duì)icaA的轉(zhuǎn)錄有極顯著的抑制作用(P<0.01)，T-La(FS)對(duì)icaA的抑制作用極顯著高于T-La(S)、RGD-T-La(S)(P<0.01)；RGD-T-La(S)、T-La(FS)、RGD-T-La(FS)對(duì)fib的轉(zhuǎn)錄有極顯著的抑制作用(P<0.01)，T-La(FS)對(duì)fib的抑制作用顯著或極顯著高于T-La(S)、RGD-T-La(S)(P<0.05、P<0.01)；表明抗菌肽能抑制icaA、fib基因的轉(zhuǎn)錄水平，且T-La(FS)的抑制作用較強(qiáng)(見(jiàn)圖6)。

圖6 抗菌肽對(duì)生物被膜相關(guān)基因icaA、 fib轉(zhuǎn)錄的影響

4 討論

金黃色葡萄球菌形成生物被膜較容易，能夠很好地防止和抵御宿主的免疫反應(yīng)，還有可能導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素及消毒劑敏感性降低，生物被膜的產(chǎn)生與其耐藥性有著密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)分離的金黃色葡萄球菌對(duì)多種臨床常用的多種抗生素耐藥。目前已有研究表明抗菌肽可以抑制細(xì)菌生物被膜的生成，本試驗(yàn)在掃描電鏡下觀察抗菌肽作用后，細(xì)菌周?chē)哪钗镔|(zhì)逐漸消失，細(xì)胞外基質(zhì)大量減少，而在對(duì)照組中的金黃色葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)較為完整。胞外蛋白在生物被膜結(jié)構(gòu)的形成和發(fā)育中同樣扮演重要的作用，試驗(yàn)結(jié)果表明抗菌肽能夠抑制金黃色葡萄球菌生物被膜胞外蛋白合成與分泌。

生物被膜形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，有多重因子參與同時(shí)受多種基因調(diào)控。由于細(xì)胞間基因調(diào)控系統(tǒng)在生物被膜形成中起著重要作用，因此生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制則生物被膜形成受到抑制。本試驗(yàn)中4種多肽對(duì)于金色葡萄球菌生物被膜內(nèi)活菌總數(shù)抑制能力由強(qiáng)到弱分別為T(mén)-La(FS)、RGD-T-La(FS)、T-La(S)、RGD-T-La(S)。半定量黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，在多肽的作用下，金黃色葡萄球菌生物被膜的形成顯著降低，T-La(FS)相比于RGD-T-La(FS)、T-La(S)、RGD-T-La(S)具有較強(qiáng)的生物被膜形成的抑制作用。通過(guò)檢測(cè)其主要生物被膜基因fib、icaA的轉(zhuǎn)錄水平，與對(duì)照組相比，fib、icaA的轉(zhuǎn)錄水平降低，且T-La(FS)的抑制作用最強(qiáng)。金黃色葡萄球菌在形成生物被膜時(shí)，細(xì)胞間的多糖黏附素在發(fā)揮著非常重要的作用，而這種多糖黏附素合成的基礎(chǔ)是ica基因，ica操縱子包括一個(gè)調(diào)節(jié)基因icaR和四個(gè)功能基因icaA、B、C、D。icaR基因位于ica基因的上游，編碼一種轉(zhuǎn)錄阻遏物，通過(guò)與DNA結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄，icaA蛋白位于細(xì)胞膜，具有N-乙酰葡萄氨基轉(zhuǎn)移酶活性，icaD是一種伴侶蛋白的可能性比較大，其主要作用能夠引導(dǎo)icaA分子能夠正確地折疊和插入細(xì)胞膜，icaB是一種分泌性蛋白質(zhì)，作用及其原理是脫去多聚N-乙酰葡聚胺分子上的乙?；琲caC是一種插入細(xì)胞膜的疏水性蛋白質(zhì)，幫助合成較長(zhǎng)的聚合物，并且能夠不斷將合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的表面。fib是一種由金黃色葡萄球菌分泌的能與纖維蛋白結(jié)合的蛋白，其能調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌的毒力和生物被膜的形成，fib轉(zhuǎn)錄水平的降低能夠減弱fib蛋白和nuc基因啟動(dòng)子之間的相互作用，從而導(dǎo)致nuc基因的表達(dá)下降，減弱生物被膜的形成能力，抗菌肽通過(guò)影響生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平可以抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。