陳長福

(龍巖市動物疫病預(yù)防控制中心，福建 龍巖 364000)

大腸桿菌血清型較多，在臨床上防控難度較大，此外由于該菌屬于條件致病菌，可引起動物和人的多種疾病，是動物細菌性疾病的主要病原菌，同時也是危害人類健康的主要病原菌之一。

美國加利福尼亞的羊場在1932年爆發(fā)了以出血性腸炎為特征的疫病，經(jīng)分離鑒定后確診為大腸桿菌病引起，這是全世界最早報道關(guān)于大腸桿菌引起羊腹瀉的報道。我國羔羊的大腸桿菌病于內(nèi)蒙和新疆在1952年首次報道。近年來羊大腸桿菌在我國內(nèi)蒙、青海、寧夏、山東、西藏等養(yǎng)羊地區(qū)仍有報道，且造成的經(jīng)濟損失較大，成為危害養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的一個疫病。

2020年9月，福建省龍巖市多個山羊養(yǎng)殖場羔羊發(fā)生嚴重腹瀉，甚至出現(xiàn)重癥病羔羊發(fā)生死亡現(xiàn)象。為明確龍巖市山羊養(yǎng)殖場羔羊病死病因，作者對病情較為嚴重的某一養(yǎng)殖場的病死羔羊進行了剖解，無菌采集肝、肺等內(nèi)臟組織進行病原分離鑒定，最終分離到1株大腸桿菌，對其進行耐藥性分析，同時對該菌株耐藥基因進行檢測，為有效防控閩西地區(qū)山羊疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2020年9月在龍巖市某山羊養(yǎng)殖場有30余只羔羊出現(xiàn)嚴重腹瀉，1周后有3只羔羊出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁等癥狀，發(fā)病1周后有只3羔羊死亡，對送檢病死羔羊立即進行剖檢可見腸道嚴重出血。

1.2 相關(guān)試劑及實驗動物

DNA/RNA提取試劑盒購自天跟生化科技(北京)有限公司；細菌革蘭氏染色液購自青島海博生物有限公司；藥敏紙片購自O(shè)xoid公司；ExTaq酶購自寶生物工程(大連)有限公司；營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂購自北京鴻潤寶順科技有限公司。BABL/c小鼠10只，購自吳氏實驗動物。

1.3 引物設(shè)計與合成

本研究所用16S rRNA引物參照Weisburg等(1991)、耐藥基因參照劉晨陽(2019)和羊常見病毒或支原體引物參照林裕勝等(2018)研究結(jié)果發(fā)表序列，由尚亞生物技術(shù)(福州)有限公司合成。

1.4 病毒支原體PCR檢測

對無菌采集的病死羔羊肺臟、肝臟、腎臟等組織取一部分制備組織勻漿，利用DNA/RNA提取試劑盒提取樣品中的核酸，參照林裕勝等(2018)研究中反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對羊口瘡、山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒、綿羊肺炎支原體等山羊常見病毒和支原體進行(RT)PCR檢測，結(jié)果均為陰性。

1.5 細菌的分離培養(yǎng)

將采集的3份病死羔羊肺臟、肝臟、腎臟等組織分別接種至血瓊脂平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，隨后用接種棒挑取單個菌落，分別接種至麥康凱、伊紅美藍和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌株在各個培養(yǎng)基上的生長情況，并將培養(yǎng)物進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.6 16S rRNAPCR鑒定

利用試劑盒提取分離菌株的DNA，并以此作為模板，通過合成的引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件參照參考文獻進行。反應(yīng)結(jié)束后PCR擴增產(chǎn)物均經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物進行回收，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化后送往尚亞生物技術(shù)(上海)有限公司進行測序。

1.7 藥敏試驗

藥敏試驗所用培養(yǎng)基、接種方法、培養(yǎng)時間及判定方法參照美國臨床和實驗室標(biāo)準協(xié)會( CLSI) 頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準》。

本研究選取了恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、阿莫西林、紅霉素、土霉素、替米考星、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢噻呋等13抗菌藥物進行藥敏試驗。

1.8 耐藥基因檢測

以1.5中提取的DNA為模板，按照劉晨陽(2019)研究中反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行PCR擴增。

1.9 動物攻毒試驗

將從3份病死羔羊樣品中分離純化到的菌株接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)24 h后，經(jīng)腹腔注射給4只實驗小鼠, 每只劑量為0.2 mL，同時腹腔注射0. 2 mL營養(yǎng)肉湯組注射4只作為陰性對照組，另取2只做空白對照，每天觀察記錄實驗小鼠的存活情況。對死亡小鼠進行剖解觀察，并對臟器組織進行劃線分離培養(yǎng)，培養(yǎng)物提取DNA后，以1.5中合成的引物按照Weisburg等(1991)研究的反應(yīng)體系和程序?qū)?6S rRNA基因進行擴增，回收PCR產(chǎn)物進行克隆測序(測序由測序公司完成)，測序結(jié)果與接種菌序列進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離培養(yǎng)及染色特性

無菌挑取組織接種至血瓊脂平板上，在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，可見血瓊脂平板上有圓形凸起的菌落，周圍出現(xiàn)溶血環(huán)。溶血菌株在麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基對應(yīng)的菌落顏色分別為玫紅色和金屬色，對分離的細菌進行革蘭氏鏡檢，均為紫紅色、無芽孢且菌體兩端呈鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌。

2.2 分離菌株16S rRNA 基因序列鑒定

通過對分離菌進行克隆測序(測序由尚亞生物科技(上海)有限公司完成)，利用DNAstar軟件對測序結(jié)果進行分析，結(jié)果顯示：本研究分離到的菌株與GenBank上公布的其它大腸桿菌的同源性高達99.8%以上(圖1)，表明該分離菌株為大腸桿菌，命名為FJ-LY2020。

圖1 16Sr RNA核苷酸序列相似性分析

2.3 藥敏試驗結(jié)果

按《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準》對FJ-LY2020進行藥敏試驗，結(jié)果(表1)顯示本菌僅對氟苯尼考高敏，對恩諾沙星、頭孢噻呋、環(huán)丙沙星等3種藥物中敏，對鏈霉素、卡那霉素、替米考星等9種藥物耐藥。

表1 藥敏試驗結(jié)果

2.4 耐藥基因檢測結(jié)果

對分離菌株進行β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、多粘菌素、四環(huán)素類、喹諾酮類的耐藥基因進行PCR檢測，結(jié)果顯示β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM在1000bp左右有擴增條帶(圖2)，四環(huán)素類耐藥基因tetC在400bp左右有擴增條帶(圖3)，其余耐藥基因未檢出。結(jié)果表明該分離菌株含有含有blaTEM和tetC耐藥基因。

圖2 blaTEM PCR檢測結(jié)果

圖3 tetC PCR檢測結(jié)果

2.5 小鼠攻毒試驗結(jié)果

在本研究中攻毒組的小鼠均在24 h內(nèi)死亡，而陰性對照組和空白組小鼠均無死亡。通過剖檢攻毒組死亡小鼠可見肝臟腫大，脾臟淤血腫大，小腸，腸壁變薄，從死亡小鼠臟器中分離培養(yǎng)細菌，對分離菌進行16S rRNA克隆測序比對分析，結(jié)果顯示分離菌與接種菌核苷酸序列一致(圖4)。

圖4 16S rRNA測序比對圖

3 討論

大腸桿菌性疾病在動物源細菌病中仍然占據(jù)主導(dǎo)地位，近年來羊大腸桿菌病流行呈現(xiàn)上升趨勢，造成嚴重的經(jīng)濟損失。本研究中的養(yǎng)殖戶對山羊集約化飼養(yǎng)意識不強，養(yǎng)殖場沒有設(shè)辦公區(qū)，且生活區(qū)與生產(chǎn)區(qū)連在一起，羊舍條件簡陋，特別是進入9月下旬以來，陰雨綿綿，羊舍泥濘，糞尿污積，該養(yǎng)殖戶沒能進一步完善設(shè)施設(shè)備，消毒制度等生物安全措施沒能有效落實，導(dǎo)致疫病時有發(fā)生。這與國內(nèi)山羔羊發(fā)病的文獻報道基本一致。為了分析該分離菌是否對抗生素產(chǎn)生耐藥，本研究對分離到的大腸桿菌按藥敏試驗操作標(biāo)準進行操作，結(jié)果顯示分離菌對紅霉素、替米考星、土霉素、四環(huán)素、阿莫西林、氨芐西林等藥物均耐藥，13種受試藥物中僅有氟苯尼考為高敏藥物，表明該地區(qū)分離的大腸桿菌已出現(xiàn)較為嚴重的耐藥現(xiàn)象。近年來羊源大腸桿菌耐藥性報道不斷增加，蘇洋洋等研究發(fā)現(xiàn)山羊大腸桿菌對卡那霉素和氨芐西林耐藥，薛俊龍等研究表明雁門關(guān)地區(qū)羊致病性大腸桿菌對氨芐西林耐藥，陳家露等研究表明西藏那曲市羊源大腸桿菌對氨芐西林和卡納霉素耐藥，這與本研究結(jié)果一致。本研究對常見抗生素耐藥基因進行檢測，PCR檢測出blaTEM和tetC基因有擴增條帶，其它耐藥基因未檢出。劉晨陽等對34株羊源耐藥菌株進行了耐藥基因檢測，其中tetC基因檢出率最高，陽性率高達70.5%，sul2基因檢出率為58.8%。本研究的結(jié)果與劉晨陽等結(jié)果一致，表明當(dāng)前羊源大腸桿菌耐藥已成普遍現(xiàn)象，應(yīng)該引起有關(guān)部門重視。之前的藥敏實驗和耐藥性基因檢測表明了該菌株已出現(xiàn)嚴重的耐藥性，為探究分離到的大腸桿菌是否具有較強的致病性，本研究通過接種BABL/c小鼠進行動物攻毒實驗，結(jié)果顯示接種分離到的大腸桿菌24 h內(nèi)全部死亡，表明該菌株具有較強的致死性。

4 小結(jié)

本研究分離到致病性強的羊源大腸桿菌，且對多種抗生素耐藥，攜帶多個耐藥基因。近年來由于在養(yǎng)殖過程中抗生素等藥物的不規(guī)范使用，使得大腸桿菌耐藥菌株不斷增多，在臨床治療該類病例時應(yīng)依據(jù)藥敏試驗結(jié)果，以提高臨床治愈效果和減少經(jīng)濟損失。