亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制▲

        2021-05-14 07:33:30胡光云關(guān)永格何孝崇全小明
        廣西醫(yī)學(xué) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:肌瘤子宮蛋白

        胡光云 關(guān)永格 宋 陽(yáng) 何孝崇 孫 哲 全小明

        (1 中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)護(hù)理系,重慶市 400038,電子郵箱:2234381336@qq.com;2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科, 廣東省廣州市 510405;3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,廣東省廣州市 510405;4 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科, 廣東省廣州市 510405 )

        子宮肌瘤是女性最常見(jiàn)的盆腔良性腫瘤[1],近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。60%~80%育齡期婦女患有子宮肌瘤[2]。然而,其具體病因尚未明確[3],有研究表明子宮肌瘤是一種雌激素依賴(lài)性疾病。某些膳食成分可以改變內(nèi)源性激素的代謝,發(fā)揮或擬雌激素作用,從而影響子宮肌瘤的發(fā)生[4]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是綠茶提取物兒茶酚胺中的主要成分,EGCG可通過(guò)抗氧化活性、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)控干細(xì)胞特性、抗血管生成、抑制轉(zhuǎn)移及DNA甲基化等多種方式,發(fā)揮抗腫瘤的作用[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),子宮肌瘤細(xì)胞中存在Wnt信號(hào)通路的活化,抑制Wnt信號(hào)通路可抑制子宮肌瘤的生長(zhǎng)[6]。本研究觀察EGCG對(duì)人子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響,并探討其相關(guān)機(jī)制,旨在為子宮肌瘤的防治提供新的思路和途徑。

        1 材料和方法

        1.1 標(biāo)本來(lái)源 本研究所用組織標(biāo)本全部取自在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)或行子宮肌瘤剔除術(shù)的患者?;颊吣挲g35~50歲,術(shù)前至少3個(gè)月沒(méi)接受激素治療,術(shù)后病理學(xué)診斷為子宮肌瘤。手術(shù)中獲取子宮肌瘤組織后立即將其保存于含有青鏈霉素的冷Hanks溶液中,低溫轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及試劑 EGCG(Sigma公司,批號(hào):C0130),杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM;Gibco公司,批號(hào):25200-056) , 胎牛血清(Gibco公司,批號(hào):10270-106), 青、鏈霉素(南京凱基生物公司,批號(hào):15140-122), 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(南京凱基生物公司,批號(hào):25200-056) , 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS;HyClone公司,SH30256.01),Ⅰ型膠原酶(Sigma公司,批號(hào):C0130),相關(guān)抗體見(jiàn)表1。 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(NAPCO series 5400);LX70倒置顯微鏡(Olympus 公司,型號(hào):CX41);全自動(dòng)拍照裝置(Lumenera公司,型號(hào):PMZO-35);水浴箱(Memert公司);低速離心機(jī)(Anke公司, 型號(hào):TDL-5c);超低溫冰箱(SANYO公司,型號(hào):MDF-U53V);電子分析天平(METTLER公司,型號(hào):AE-200);酶標(biāo)儀(Thermo公司, 型號(hào):Multiskan MK3);電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Bio-Rad公司);電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司,型號(hào):DK-8D);旋渦振蕩器(海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠,型號(hào):QL-901)。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8(cell counting kit-8,CCK-8;Abcam公司,ab134813);4%多聚甲醛(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科自備);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自Sigma公司;羊抗鼠二抗購(gòu)自中杉金橋(批號(hào):PV-6002)。

        表1 主要抗體

        1.3 EGCG溶液的配置 取EGCG凍干粉,用PBS溶解,儲(chǔ)存濃度為2 000 μmol/L,置于4℃冰箱保存,用時(shí)稀釋為所需濃度。

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1.4.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定:采用改良培養(yǎng)方式獲取人子宮肌瘤細(xì)胞[7]。從手術(shù)室取人子宮肌瘤組織后,立即剪為1 mm左右的組織塊,將0.2% Ⅰ型膠原酶與組織塊按體積2 ∶1混勻,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化5~6 h,收集濾液,終止消化。過(guò)濾留濾網(wǎng)上的組織塊,再次消化1 h后過(guò)濾組織懸液,終止消化,收集細(xì)胞懸液。將終止消化后的細(xì)胞懸液,常溫下1 000 r/min離心5 min后棄上清,加入10%濃度培養(yǎng)液(DMEM+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素)吹打均勻,再次常溫下1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入10%濃度的完全培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)瓶中,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。經(jīng)免疫組化檢測(cè)鑒定后傳代培養(yǎng),本研究選取第3~6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將第3~6代細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng),置于37℃、含5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中,2~3 d換液一次。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),每2~3 d傳代1次,取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及人子宮肌瘤細(xì)胞增殖活性的檢測(cè):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮肌瘤細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,將細(xì)胞接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組,各劑量組分別加入相應(yīng)濃度的EGCG,對(duì)照組加入同體積的PBS。另設(shè)凋零組(只有緩沖液,沒(méi)有加入細(xì)胞以及EGCG)。分別在干預(yù)24 h、48 h及72 h后,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后棄上清,使用PBS輕柔清洗96板孔,加入100 μL配置好的CCK8溶液,培養(yǎng)箱中孵育1~2 h后,于酶標(biāo)儀450 nm讀取各孔的吸光度值(A)。計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=[A(加藥)-A(凋零)]/[A(對(duì)照)-A(凋零)]×100%。每組設(shè)定5 個(gè)復(fù)孔。

        1.4.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)定Wnt5b、β-Catenin蛋白表達(dá):調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,接種到預(yù)先鋪好爬片的24孔板中,每孔1 mL細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分為對(duì)照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組,待細(xì)胞融合達(dá)80%后,各劑量組分別加入相應(yīng)濃度的EGCG,對(duì)照組加同體積的PBS。干預(yù)48 h后,棄原液,加入預(yù)冷的PBS沖洗3次,加入4%的多聚甲醛固定30 min,再棄甲醛,加入少量PBS(覆蓋玻片即可),放入4℃冰箱中保存待用。采用常規(guī)免疫組化染色法進(jìn)行檢測(cè),以PBS代替一抗,二氨基聯(lián)苯胺顯色后應(yīng)用軟件Image J觀察圖片,以Wnt5b、β-Catenin蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞單位面積的平均光密度,代表此蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。其中平均光密度是積分光密度與圖像面積的商,積分光密度是觀察區(qū)域內(nèi)所用陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.4.4 免疫印跡試驗(yàn)測(cè)定Wnt5b、β-Catenin、EGFR蛋白表達(dá):將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,接種于6孔板中,每孔3 mL細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分為對(duì)照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組。待細(xì)胞融合達(dá)80%后,各劑量組分別加入相應(yīng)濃度的EGCG,對(duì)照組加同體積的PBS。藥物干預(yù)48 h后,提取細(xì)胞總蛋白,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,按25 μg/L進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至 NC膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST漂洗 6次,加入一抗(EGFR、Wnt5b稀釋比均為1 ∶1 000;β-Catenin稀釋比為1 ∶500,GAPDH稀釋比為1 ∶500),4℃冰箱孵育過(guò)夜,TBST漂洗 6次,加入二抗 (稀釋比為1 ∶4 000 ),室溫反應(yīng)2 h,TBST 漂洗6次,于Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描結(jié)果并分析,以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,Levene檢驗(yàn)方差齊性,若方差齊,采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較,若方差不齊,則使用Dunnett T3法進(jìn)行兩兩比較;不服從正態(tài)分布的資料以M(P25,P75)表示,采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)的秩和檢驗(yàn);重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組人子宮肌瘤細(xì)胞存活率的比較 4組人子宮肌瘤細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=78.929,P組間<0.001),各干預(yù)組細(xì)胞存活率均有隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)(F時(shí)間=44.753,P時(shí)間<0.001),分組與時(shí)間有交互作用(F交互=7.213,P交互<0.001);其中干預(yù)48 h、72 h后,對(duì)照組、50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組人子宮肌瘤細(xì)胞存活率依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

        表2 不同時(shí)間點(diǎn)4組人子宮肌瘤細(xì)胞存活率的比較(x±s,%)

        2.2 各組細(xì)胞形態(tài) 干預(yù)48 h后,對(duì)照組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,橢圓形細(xì)胞核位于中央,細(xì)胞融合后平行成束生長(zhǎng);50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組的細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)明顯的變化,細(xì)胞出現(xiàn)大面積的沙樣化,細(xì)胞核變化不大,但細(xì)胞輪廓及細(xì)胞之間的連接模糊不清,并大部分死亡。見(jiàn)圖1。

        圖1 不同濃度EGCG作用人子宮肌瘤細(xì)胞48 h后形態(tài)的改變(×100)

        2.3 4組人子宮肌瘤相關(guān)蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 各濃度EGCG干預(yù)組Wnt5b、β-Catenin蛋白表達(dá)強(qiáng)度均低于對(duì)照組,200 μmol/L EGCG組Wnt5b蛋白表達(dá)強(qiáng)度低于其他兩個(gè)濃度干預(yù)組,50 μmol/L EGCG組、100 μmol/L EGCG組、200 μmol/L EGCG組β-Catenin蛋白表達(dá)強(qiáng)度依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3、表3。

        圖2 β-Catenin蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)

        圖3 Wnt5b蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)

        表3 各組細(xì)胞 Wnt5b、β-Catenin蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比較(x±s)

        2.4 4組人子宮肌瘤相關(guān)蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 各濃度EGCG干預(yù)組EGFR、β-Catenin蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組,100、200 μmol/L EGCG組的Wnt5b蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組(均P<0.05);200 μmol/L EGCG組的EGFR、Wnt5b蛋白表達(dá)水平均低于其他兩個(gè)干預(yù)組(均P<0.05)。見(jiàn)表4和圖4。

        表4 各組EGFR、Wnt5b、β-Catenin蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

        圖4 4組蛋白免疫印跡試驗(yàn)條帶

        3 討 論

        子宮肌瘤是一種常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)良性腫瘤,其發(fā)病機(jī)制并未完全闡明,多種因素的相互作用可以誘導(dǎo)和促進(jìn)子宮肌瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。研究表明,年齡、既往婦科炎癥史、基因、飲食習(xí)慣、社會(huì)心理因素及環(huán)境等都是影響子宮肌瘤發(fā)生的因素,其中年齡、基因等為不可抗力因素,而飲食習(xí)慣、情志因素、環(huán)境因素為可控因素,因此可從可控因素著手預(yù)防子宮肌瘤[9]。

        綠茶是人們?nèi)粘I钪械某R?jiàn)飲品,其主要成分EGCG占綠茶茶多酚的50%~75%,EGCG可以通過(guò)促進(jìn)抑癌基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)甲基化水平、抗血管形成、調(diào)節(jié)微小RNA表達(dá)、調(diào)節(jié)自噬活性、影響多條信號(hào)通路等途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[10-11],且沒(méi)有明顯的毒副作用[12]。臨床研究顯示,EGCG作為潛在的安全高效、純天然的腫瘤防治藥物,可能在預(yù)防腫瘤發(fā)生、減緩腫瘤進(jìn)展、防止腫瘤復(fù)發(fā)、增強(qiáng)化療敏感性、減輕化療不良反應(yīng)、預(yù)防化療耐藥等方面起到積極作用[13]。張秋妍[14]采用EGCG干預(yù)子宮肌瘤細(xì)胞,結(jié)果顯示,EGCG可以通過(guò)提高子宮肌瘤細(xì)胞中第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物蛋白的表達(dá),下調(diào)磷酸化蛋白激酶B的表達(dá),發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用。

        在子宮肌瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中存在增殖和凋亡的失衡,體內(nèi)細(xì)胞的凋亡受到抑制是該病的一個(gè)重要特征[15]。研究表明,Wnt信號(hào)通路與子宮肌瘤的發(fā)生密切相關(guān),經(jīng)典信號(hào)通路Wnt/β-Catenin是子宮肌瘤發(fā)病過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16-18]。Wnt/β-Catenin是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng),在胚胎發(fā)育、維持器官及組織穩(wěn)態(tài)方面,發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在一般狀態(tài)下,Wnt蛋白通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面受體,經(jīng)跨膜受體卷曲蛋白傳遞信號(hào)給β-Catenin。大部分β-Catenin位于細(xì)胞膜,β-Catenin和其他蛋白構(gòu)成無(wú)活性的復(fù)合物。經(jīng)典 Wnt信號(hào)通過(guò)失活的糖原合成酶激酶抑制β-Catenin降解,β-Catenin繼而被轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)[19-20],從而激活轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子,啟動(dòng)靶基因,被激活的靶基因可引起細(xì)胞異常增殖。有研究顯示,EGFR在子宮肌瘤組織中的表達(dá)水平高于正常子宮組織,而上皮生長(zhǎng)因子可使離體子宮肌瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng),提示上皮生長(zhǎng)因子、EGFR與子宮肌瘤關(guān)系密切[21]。還有研究顯示[22],EGFR可與β-Catenin信號(hào)通路相互作用,促使β-Catenin在核內(nèi)聚集;同時(shí)EGFR又是β-Catenin直接的作用靶點(diǎn),可減少游離β-Catenin入核。

        本研究結(jié)果顯示,EGCG能有效抑制人子宮肌瘤細(xì)胞增殖,且呈一定的時(shí)間及濃度依賴(lài)性;免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示,Wnt5b、β-Catenin在細(xì)胞胞漿中表達(dá),EGCG對(duì)其表達(dá)有抑制作用,且有一定的濃度依賴(lài)性。這提示EGCG可能通過(guò)抑制Wnt5b、β-Catenin蛋白的表達(dá),發(fā)揮抑制人子宮肌瘤細(xì)胞增殖的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果,我們采用免疫印跡試驗(yàn)法檢測(cè)Wnt5b、β-Catenin、EGFR的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,各濃度EGCG干預(yù)組EGFR、β-Catenin蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組,100、200 μmol/L EGCG組的Wnt5b蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組,200 μmol/L EGCG組的EGFR、Wnt5b蛋白表達(dá)水平均低于其他兩個(gè)干預(yù)組(均P<0.05)。這提示EGCG可抑制Wnt5b、β-Catenin、EGFR蛋白的表達(dá),且有一定的濃度依賴(lài)性。EGFR可減少游離β-Catenin入核,抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路活化[23],因此EGCG可能通過(guò)降低EGFR表達(dá)從而抑制Wnt5b、β-Catenin表達(dá),進(jìn)而抑制人子宮肌瘤細(xì)胞的增殖。

        綜上所述,EGCG可能通過(guò)抑制人子宮肌瘤細(xì)胞中Wnt5b、β-Catenin、EGFR蛋白的表達(dá),從而抑制人子宮肌瘤細(xì)胞的增殖。

        猜你喜歡
        肌瘤子宮蛋白
        子宮多了一坨肉——子宮縱隔
        子宮肌瘤和懷孕可以共存嗎
        假如沒(méi)有了子宮
        你了解子宮肌瘤嗎
        肺淋巴管肌瘤病肺內(nèi)及肺外CT表現(xiàn)
        子宮多了一坨肉——子宮縱隔
        假如沒(méi)有了子宮
        你了解子宮肌瘤嗎
        豬胎盤(pán)蛋白的分離鑒定
        中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:00
        自噬蛋白Beclin-1在膽囊癌中的表達(dá)及臨床意義
        精品无码日韩一区二区三区不卡 | 亚洲女厕偷拍一区二区| 成人免费自拍视频在线观看| 国产一区二区三区乱码| 国产乱人伦精品一区二区| 911国产在线观看精品| 一区二区三区精彩视频在线观看| 一区二区三区四区亚洲免费| 伊人久久精品无码av一区| 日本免费a级毛一片| 污污污污污污污网站污| 国产一区二区三区视频免费在线 | 久久中文字幕日韩无码视频| 亚洲一区二区三区综合网| 国产三级精品和三级男人| 国产精品久久久久一区二区三区 | 国产乱了真实在线观看| 内射精品无码中文字幕| 色yeye在线观看| 国产91大片在线观看| 中文字幕亚洲一区二区不下| 国产成+人+综合+亚洲欧美丁香花| 精品国产av 无码一区二区三区 | 午夜香蕉av一区二区三区| 免费国产一区二区视频| 欧美激情综合色综合啪啪五月| 好屌草这里只有精品| 欧美乱人伦中文字幕在线不卡| 亚洲人妻av在线播放| 免费在线观看av不卡网站| 色哟哟精品视频在线观看| 又爆又大又粗又硬又黄的a片| 麻豆AV无码久久精品蜜桃久久| 亚洲一区二区在线观看av| 亚洲色图片区| 人妻影音先锋啪啪av资源 | 久久精品国产亚洲av高清蜜臀| 三上悠亚亚洲精品一区| 色欲综合一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久秋霞| 开心五月婷婷综合网站|