梁 雯 白 華 林曉琰 黃麗英 黃 寧

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院婦科門診，南寧市 530003，電子郵箱：1839027400@qq.com)

大量研究證實，高危型人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的必要條件，而其中70%的宮頸癌由高危HPV 16/18型感染引起[1-2]。因此，中國優(yōu)生科學(xué)協(xié)會陰道鏡和宮頸病理學(xué)分會專家委員會在相關(guān)的指南[3]中建議，對于高危HPV 16/18型感染者，應(yīng)采用立即轉(zhuǎn)診陰道鏡的措施。但是單純的HPV篩查往往敏感度高而特異度較低，其結(jié)果會對臨床進(jìn)一步治療方案的制定造成干擾，相當(dāng)一部分醫(yī)師會采取過度的治療方式，這會進(jìn)一步影響患者的身心健康。

目前，研究表明HPV E6和E7蛋白在宮頸腫瘤的形成過程中起重要作用[4]，是在HPV致癌過程中唯一全程表達(dá)的蛋白。本研究通過對比E6/E7 mRNA檢測及液基細(xì)胞學(xué)檢查對HPV 16/18陽性患者的高級別病變的診斷效能，探討采用E6/E7 mRNA檢測方法用于分流HPV 16/18陽性患者的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年12月至2018年12月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院婦科門診就診的200例HPV感染患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：行宮頸癌機會性篩查，經(jīng)HPV分型檢測出單純HPV16或HPV18型DNA陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在宮頸癌臨床癥狀的患者。納入患者的年齡22～72(35.43±8.90)歲，其中HPV16型感染者147例，HPV18型感染者53例。本研究通過廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，所有研究對象均對本研究知情理解并簽署知情同意書。

1.2 液基細(xì)胞學(xué)及高危型HPV-DNA的檢測方法 檢查前24 h禁止性行為，3 d內(nèi)不可沖洗生殖道，禁止生殖道用藥。檢查時均使用一次性宮頸脫落細(xì)胞采集器，在患者的宮頸處順時針旋轉(zhuǎn)3～5周采集上皮細(xì)胞樣本，置于樣本管內(nèi)多次攪拌后進(jìn)行檢查。(1)使用安必平公司的全自動液基細(xì)胞制片系統(tǒng)進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)制片，根據(jù)Bethesda分級系統(tǒng)[5]進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷，包括正常范圍、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cell of unknown significance，ASCUS)、鱗狀上皮內(nèi)病變和鱗狀細(xì)胞癌，其中鱗狀上皮內(nèi)病變分為低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。以細(xì)胞學(xué)ASCUS以上設(shè)定為細(xì)胞學(xué)陽性。(2)使用Cobas 4800 HPV測試系統(tǒng)(PCR熒光法)檢測HPV-DNA，該檢測系統(tǒng)包括Cobas x480 DNA提取儀、Cobas z480實時熒光定量 PCR 儀及循環(huán)數(shù)(Ct)值自動讀取軟件平臺，Cobas HPV 檢測試劑盒購自美國羅氏公司。 嚴(yán)格按照檢測系統(tǒng)及相關(guān)試劑的說明書進(jìn)行操作，主要步驟：首先進(jìn)行全自動 DNA 提取和PCR 板加樣,然后通過 PCR 擴增儀擴增目標(biāo)DNA序列；將擴增的DNA序列與相應(yīng)熒光探針結(jié)合，檢測的熒光探針有4種，分別為 HPV16、HPV18、β-球蛋白和其他12種高危型HPV (HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68)探針,4種探針分別用不同顏色的熒光染料標(biāo)記，通過實時測定熒光信號確定樣本中HPV種類及含量。在單次檢測中可同時檢測14種高危型HPV，以Ct值來標(biāo)記病毒負(fù)荷量，若Ct值<40.0則判定為 HPV 陽性。任何一種HPV亞型陽性， 檢測結(jié)果即為陽性； 多重感染為兩種及以上 HPV 亞型同時陽性。

1.3 E6/E7 mRNA的檢測方法 檢查前要求同1.2。將采集刷置入宮頸管，旋轉(zhuǎn)，收集脫落細(xì)胞(宮頸管、宮頸口)，將采集刷置入標(biāo)本瓶(含細(xì)胞保存液)，旋轉(zhuǎn)、震蕩，使細(xì)胞落入保存液中。采用支鏈DNA信號放大技術(shù)，使用Quanti VirusTMHPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒(PCR熒光探針法，科蒂亞生物技術(shù)有限公司)檢測E6/E7 mRNA。標(biāo)本經(jīng)過裂解、雜交捕獲、信號放大、酶促化學(xué)發(fā)光后，使用冷光儀(科蒂亞生物技術(shù)有限公司)檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。 該試劑盒可檢測世界衛(wèi)生組織公布的14種高危亞型HPV E6/E7 mRNA，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68(不分型)，超過發(fā)光閾值即為陽性。

1.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 在患者知情同意的情況下，由2名經(jīng)過陰道鏡專業(yè)培訓(xùn)的專職醫(yī)師進(jìn)行陰道鏡檢查。在陰道鏡觀察異常處取活檢，如陰道鏡檢查無異常，則在3、6、9、12點方向行隨機活檢，如發(fā)現(xiàn)陰道鏡宮頸Ⅲ型轉(zhuǎn)化區(qū)，則行宮頸管搔刮術(shù)。將所取組織存放在10%的福爾馬林溶液中固定，做成切片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察并診斷。診斷結(jié)果分為：宮頸黏膜慢性炎；LSIL，包括宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)1、CIN2 P16(-)；HSIL，包括CIN2 P16(+)、CIN3；原位腺癌；鱗狀細(xì)胞癌；腺癌。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 200例HPV 16/18型感染患者的宮頸病變檢出情況 200例HPV 16/18型感染者中，經(jīng)病理確診宮頸黏膜慢性炎85例(42.5%)，LSIL[CIN1或CIN2 P16(-)]56例(28.0%)，CIN2 P16(+) 31例(15.5%)，CIN3 21例(10.5%)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌7例(3.5%)，其中CIN2 P16(+)及以上病變檢出率為29.5%(59/200)。

2.2 200例HPV 16/18型患者的HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果和液基細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果 200例HPV 16/18型感染患者中，共107例患者HPV E6/E7 mRNA陽性，93例陰性，其中HPV E6/E7 mRNA陽性者、陰性者的HSIL及以上病變檢出率分別為47.66%(51/107)、8.60%(8/93)，前者的檢出率高于后者(χ2=36.502，P<0.001)；共56例患者液基細(xì)胞學(xué)陽性，其中ASCUS 39例，LSIL 12例， HSIL 5例。

2.3 不同級別宮頸病變患者的HPV E6/E7 mRNA、液基細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果比較 隨著宮頸病變病理級別的提高，HPV E6/E7 mRNA 陽性率呈升高趨勢(均P<0.05)，但液基細(xì)胞學(xué)異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同級別宮頸病變患者HPV E6/E7 mRNA及液基細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果比較[n(%)]

2.4 HPV E6/E7 mRNA及液基細(xì)胞學(xué)檢測對宮頸上皮內(nèi)病變的診斷效能 以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)(HSIL及以上病變均歸為病理結(jié)果陽性)，評價HPV E6/E7 mRNA陽性、液基細(xì)胞學(xué)陽性診斷HSIL及以上病變的效能。HPV E6/E7 mRNA診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為86.44%、60.28%，液基細(xì)胞學(xué)的靈敏度、特異度分別為25.42%、70.92%，HPV E6/E7 mRNA的靈敏度高于液基細(xì)胞學(xué)(χ2=44.559，P<0.001)，兩種方法的特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.536，P=0.060)，見表2、表3。

表2 E6/E7 mRNA對HSIL及以上病變的診斷結(jié)果(n)

表3 液基細(xì)胞學(xué)檢查對HSIL及以上病變的診斷結(jié)果(n)

3 討 論

感染高危型HPV是引起宮頸癌的必要條件[2]，然而大多數(shù)HPV感染后常表現(xiàn)為無癥狀和癥狀一過性，可在2年內(nèi)被清除[6]。HPV-DNA檢測雖然具有較高的敏感度，但特異度相對較低[4]，特異性不高的根本原因在于感染普遍性以及感染后一過性感染消除的特點，檢測結(jié)果陽性只能證明曾經(jīng)有過的感染，目前體內(nèi)病毒是否已經(jīng)清除、是否持續(xù)感染、是否會進(jìn)一步導(dǎo)致病變及發(fā)展甚至致癌，并不能得到證實。因此HPV-DNA可能檢測出過多臨床無意義的感染，不能更好地反映宮頸細(xì)胞的病變程度。Khan等[7]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)HPV16陽性，10年中17.2%的患者進(jìn)展到宮頸癌前病變或?qū)m頸癌；持續(xù)HPV18陽性，10年中13.6%的患者進(jìn)展到宮頸癌前病變或?qū)m頸癌。本研究對200例HPV 16/18型感染者進(jìn)行陰道鏡活檢，結(jié)果顯示CIN2 P16(+)及以上病變檢出率僅為29.5%(59/200)，這提示對于HPV 16/18型感染的患者，積極的陰道鏡檢查可能存在過度診斷，且侵入性的活檢操作會給患者帶來不適感，并增加治療費用及患者的心理負(fù)擔(dān)，因此應(yīng)該對患者進(jìn)一步的分流，以避免不必要的檢查。

E6、E7蛋白分別是由E6、E7基因編碼的癌蛋白，主要存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中。E6和E7蛋白都具有獨立導(dǎo)致人類細(xì)胞永生化的能力，但兩者共同表達(dá)具有協(xié)同作用，可以增強轉(zhuǎn)化能力[8]。E6和E7蛋白可協(xié)同作用使得中心體復(fù)制與細(xì)胞周期脫偶聯(lián)，干擾紡錘體檢測點功能，導(dǎo)致中心體數(shù)目變化、分裂，改變基因組完整性，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展[9]。E6蛋白使p53調(diào)節(jié)的G1/S節(jié)點失控，并具有抑凋亡作用、激活端粒酶作用，E7蛋白可滅活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物pRB、p21和p27，激活細(xì)胞周期蛋白 A和E，干擾干擾素的產(chǎn)生，并抑制抗原遞呈， 通過這些途徑共同作用導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性和基因突變等腫瘤促發(fā)事件不斷積累，使細(xì)胞永生化和轉(zhuǎn)化[10-12]。因此E6蛋白和E7蛋白在抗凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等方面有協(xié)同作用。

與HPV-DNA檢測不同的是，RNA檢測可以檢測到轉(zhuǎn)錄活性的病毒。在致癌作用過程中，病毒的DNA融合經(jīng)常發(fā)生，引起病毒基因E2區(qū)開放讀碼框發(fā)生損壞，導(dǎo)致病毒癌基因E6和E7的上游調(diào)節(jié)發(fā)生異常，從而使E6和E7致癌基因表達(dá)而產(chǎn)生E6/E7 mRNA，進(jìn)一步產(chǎn)生E6和E7癌蛋白；而癌蛋白可以使P53和pRB等細(xì)胞生長抑制基因失活，增加宮頸癌發(fā)生的危險性。相比于HPV-DNA，HPV E6/E7 mRNA與宮頸癌變的相關(guān)性更強，具有較高的特異性和陽性預(yù)測值。有學(xué)者提出，檢測到HPV-DNA只能說明病毒的存在，而E6/E7 mRNA表達(dá)、轉(zhuǎn)錄活性增加才具有診斷和預(yù)測價值[13]。因此，可通過檢測E6/E7的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，監(jiān)視HPV致癌基因活躍轉(zhuǎn)錄及其對宿主細(xì)胞的影響[14]。多個研究已經(jīng)表明，無論對于一般人群還是已有細(xì)胞學(xué)改變的人群，使用E6/E7 mRNA篩查CINⅡ以上病變均可達(dá)到良好的效果，其對腺上皮病變也具有相當(dāng)高的靈敏度。例如，Oliveira等[15]在普通人群中比較E6/E7 mRNA和雜交捕獲2代技術(shù)兩種檢測方法對于宮頸上皮內(nèi)病變的診斷效能，發(fā)現(xiàn)前者靈敏度明顯低于后者(分別為79.3%、96.4%)，而特異度遠(yuǎn)高于后者(分別為72.6%、42.8%)。Stoler等[16]則在939例細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS女性人群中同時使用E6/E7 mRNA和雜交捕獲2代技術(shù)檢測進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)E6/E7 mRNA檢測CINⅡ以上和CINⅢ以上病變的特異度(62.6%和59.8%)均顯著高于雜交捕獲2代技術(shù)(55.8%和53.3%)，但兩者的靈敏度并無差異。同時，E6/E7 mRNA檢測與PCR檢測HPV-DNA也有相似效果。Koliopoulos等[17]發(fā)現(xiàn)E6/E7 mRNA陽性的ASCUS女性比HPV-DNA陽性的女性更易患CINⅡ級及以上病變；在一般人群中，E6/E7 mRNA的特異度(81.7%)高于HPV-DNA(58.6%)，但靈敏度(77.0%)低于HPV-DNA(95.0%)。Hovland等[18]則發(fā)現(xiàn)E6/E7 mRNA檢測對宮頸腺癌的靈敏度和特異度與HPV-DNA檢測相似，可以彌補細(xì)胞學(xué)檢查對宮頸腺上皮病變診斷靈敏度低的缺陷。本研究結(jié)果顯示，HPV E6/E7 mRNA陽性者HSIL及以上病變檢出率高于陰性者(均P<0.05)，且隨著宮頸病變病理級別的提高，HPV E6/E7 mRNA陽性率呈升高趨勢(均P<0.05)，但液基細(xì)胞學(xué)異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這提示HPV E6/E7 mRNA陽性與宮頸病變病理級別密切相關(guān)。此外，HPV E6/E7 mRNA診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為86.44%、60.28%，其中靈敏度高于液基細(xì)胞學(xué)(P<0.05)，而兩種方法的特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這提示HPV E6/E7 mRNA對于HPV 16/18型感染者的高級別病變具有較好的診斷效能，可考慮使用此檢測方法對HPV 16/18性患者進(jìn)行分流，以利于減輕患者的心理負(fù)擔(dān)及損傷，降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，提高陰道鏡診斷率以及宮頸癌前病變及宮頸癌的檢出率。

總之，E6/E7 mRNA檢測對HPV 16/18型感染者的HSIL及以上病變具有一定的診斷效能，或可用于患者的進(jìn)一步分流，以降低陰道鏡的轉(zhuǎn)診率。