吳 眩

(西安市奶牛育種中心，陜西 西安 710000)

Calsarcin-2又名FATZ、MYOZ1，是Calsarcins(Calcineurin-associated sarcomeric protein)家族成員之一，Calsarcins家族通過(guò)去磷酸化，調(diào)控Ca2+信號(hào)途徑，進(jìn)而影響肌肉相關(guān)基因的表達(dá)。Frey等人最早推斷Calsarcin-2為一種肌原節(jié)蛋白家族，并能影響肌肉收縮，Takada利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究了calsarcin-2蛋白和骨骼肌Z線附近的r-細(xì)絲蛋白和a-輔肌動(dòng)蛋白相互作用規(guī)律。骨骼肌的肌纖維的數(shù)量和組成對(duì)豬肉品質(zhì)有很大影響，而Calsarcin-2作為Z-Disc中的結(jié)構(gòu)蛋白存在，因此Calsarcin-2基因可能在肌纖維的分化和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，從而對(duì)豬肉品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。本研究以Calsarcin-2基因作為目標(biāo)基因，采用測(cè)序，結(jié)合胴體及肉質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為豬從分子水平進(jìn)行遺傳改良提供方法和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

貴州白香豬(17頭)及雜交品種貴州白香豬×大約克(24頭)、貴州白香豬×長(zhǎng)白(13頭)、貴州白香豬×杜洛克(11頭)、貴州白香豬×貴州白香豬×長(zhǎng)白(23頭)，均來(lái)自貴州大學(xué)香豬育種場(chǎng)，靜脈采血，提取DNA備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)豬Calsarcin-2基因序列(NCBI登錄號(hào)：DQl43042)，設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，由上海生工有限公司合成，具體見(jiàn)表1。

1.2.2 2)PCR擴(kuò)增 PCR采用15 μL反應(yīng)體系：PCR緩沖液1.5 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；超純水9.1 μL；dNTPs 1.2 μL；聚合酶1 U；模板 1 μL。PCR程序：預(yù)變性94 ℃5 min；變性94 ℃30 s，退火X ℃30 s(詳見(jiàn)表1)，延伸72 ℃30 s，30個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃10 min；4 ℃保存。

表1 豬Calsarcin-2基因引物信息

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將合格擴(kuò)增結(jié)果送交上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件對(duì)SNPs位點(diǎn)基因型與豬胴體及肉質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 PCR擴(kuò)增

豬Calsarcin-2基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1，4對(duì)引物擴(kuò)增片段整齊清晰、特異性好，長(zhǎng)度都與預(yù)期大小一致。

2.2 基因分型

利用DNAStar軟件，根據(jù)測(cè)序峰圖，與GenBank中的Calsarcin-2基因序列比對(duì)，在Calsarcin-2基因第一內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs位點(diǎn)：g.613 T>C(圖2)和g.936 C>G(圖3)，這2個(gè)變異位點(diǎn)均包括2種基因型。

1.P1的PCR產(chǎn)物；2.P2的PCR產(chǎn)物；3.P3的PCR產(chǎn)物；4.P4的PCR產(chǎn)物；M.50bp DNA Ladder

AA 型 AB型

CC型 DD型

2.3 Calsarcin-2基因多態(tài)性與胴體及肉質(zhì)相關(guān)聯(lián)分析

對(duì)88頭豬個(gè)體胴體及肉質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果(見(jiàn)表2)表明：在613T>C位點(diǎn)，AA型個(gè)體在背膘厚、胴體重及眼肌面積指標(biāo)上顯著優(yōu)于AB型個(gè)體(P<0.05)，而在大理石紋、滴水損失、剪切力、肌內(nèi)脂肪及肌纖維直徑方面則相反，在屠宰率及pH值指標(biāo)上兩者差異不顯著(P>0.05)；在936 C>G位點(diǎn)，CC型個(gè)體在大理石紋、滴水損失、剪切力及肌纖維直徑指標(biāo)上顯著優(yōu)于DD型個(gè)體(P<0.05)，在背膘厚指標(biāo)上則相反，CD型個(gè)體在屠宰率指標(biāo)上顯著優(yōu)于CC及DD型個(gè)體(P<0.05)，在屠宰率、眼肌面積、pH值及肌內(nèi)脂肪指標(biāo)上三者差異均不顯著(P>0.05)。

表2 Calsarcin-2基因第1內(nèi)含子多態(tài)性與胴體及肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

本研究以大約克豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬和貴州白香豬雜交及回交的后代為研究對(duì)象，對(duì)豬Calsarcin-2基因第一內(nèi)含子進(jìn)行了多態(tài)性分析，為進(jìn)一步揭示Calsarcin-2基因多態(tài)性與功能提供基礎(chǔ)。測(cè)序結(jié)果顯示在Calsarcin-2基因第一內(nèi)含子613位堿基處發(fā)生一個(gè)由T→C的堿基轉(zhuǎn)換，但只出現(xiàn)了AA與AB基因型，卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因型BB。與胴體及肉質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)：含AB基因型個(gè)體的肉質(zhì)性狀數(shù)據(jù)優(yōu)于含AA基因型個(gè)體的數(shù)據(jù)，推測(cè)B等位基因很可能是豬肉質(zhì)性狀的一個(gè)有利基因，可以通過(guò)人工選擇來(lái)增加其在群體中的基因頻率；而在胴體性狀方面，AA基因型個(gè)體則多優(yōu)于AB型，A等位基因很可能是豬胴體性狀的一個(gè)有利基因，這就提示我們?cè)谶M(jìn)行育種工作時(shí)應(yīng)結(jié)合多個(gè)基因位點(diǎn)來(lái)選擇有利的胴體及肉質(zhì)性狀。

Calsarcin-2基因第一內(nèi)含子936 bp處發(fā)生C→G突變，該突變位點(diǎn)與背膘厚、胴體重、大理石紋、滴水損失、肌內(nèi)脂肪的影響差異顯著，含CC基因型個(gè)體的肉質(zhì)性狀數(shù)據(jù)優(yōu)于含DD基因型個(gè)體的數(shù)據(jù)，這表明C等位基因在肉用性狀的選育中可能是一個(gè)有利基因，這提示我們?cè)谝院蟮呢i選育工作中可以考慮選擇含有C等位基因的個(gè)體，不斷提高CC基因型個(gè)體在群體中的比例。