押玉柯，夏 敏*，李 軍，吳少英

(1. 南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南南陽(yáng) 473061；2. 廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260；3. 海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228)

紅火蟻SolenopsisinvictaBuren屬于膜翅目Hymenoptera蟻科Formicidae切葉蟻亞科Mymicinae火蟻屬Solenopsis(Vinson, 1997)，是一種原產(chǎn)于南美洲巴拉那河流域的危險(xiǎn)性害蟲(chóng)。2003年10月在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)有紅火蟻危害，2004年9月在中國(guó)大陸廣東吳川市首次發(fā)現(xiàn)(曾玲等，2005)。作為一種新的入侵害蟲(chóng)，紅火蟻蟻巢一旦遭到破壞，會(huì)迅速爬出巢穴，叮咬破壞者，嚴(yán)重威脅公共安全(Tschinkel, 1993)。人體被紅火蟻叮咬后有如針刺般的疼痛，過(guò)敏者會(huì)有膿包、瘙癢等癥狀，嚴(yán)重的可能會(huì)出現(xiàn)過(guò)敏性休克甚至死亡(Jamesetal., 1976)。同時(shí)，紅火蟻也會(huì)危害當(dāng)?shù)剞r(nóng)作物，破壞本地物種的生物多樣性。通過(guò)取食作物的種子、果實(shí)、幼芽、幼莖及根系，造成農(nóng)作物大面積減產(chǎn)(Steward and Vinson, 1991)。通過(guò)捕食、競(jìng)爭(zhēng)空間等途徑降低入侵地生物尤其本地螞蟻的物種豐富度和生物多樣性(Porter and Savignano, 1990; Pennisi, 2000；楊偉東等，2005；沈鵬等，2007)。

昆蟲(chóng)體內(nèi)存在著多種內(nèi)生菌，并且其體內(nèi)的微生物具有豐富的生物多樣性。內(nèi)生菌分布于昆蟲(chóng)的胸腺、食道、腸道、唾液腺、馬氏管等組織部位，但主要分布在腸道和體液中(薛寶燕等，2004；郭軍等，2015)。昆蟲(chóng)的種類不同，內(nèi)生菌的分布也會(huì)有差異，內(nèi)生菌的分布與生活定殖的環(huán)境也有很大的關(guān)系，但主要受培育的影響(譚周進(jìn)等，2005)。昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)伴隨著宿主昆蟲(chóng)的取食、消化、排泄等生理活動(dòng)，其中共生菌非常豐富，一般認(rèn)為這些共生菌是宿主正常生長(zhǎng)所必需的(彩萬(wàn)志，1990)。腸道微生物主要消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，甚至有些腸道微生物還能夠合成生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。張焱等(2016)發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)的內(nèi)生菌和線粒體一樣，由宿主通過(guò)垂直傳播的方式傳遞給后代，也可以在物種內(nèi)和物種間進(jìn)行水平傳播，有研究結(jié)果顯示，寄主內(nèi)共生菌可以通過(guò)昆蟲(chóng)天敵寄生蜂進(jìn)行水平傳播(鄭慶偉，2015)。昆蟲(chóng)的內(nèi)生菌分為原生內(nèi)生菌和次生內(nèi)生菌(譚周進(jìn)，2005；黃旭，2016)。原生內(nèi)生菌一般依靠垂直傳遞(徐紅星等，2009)，主要分布在特殊細(xì)胞內(nèi)，為宿主昆蟲(chóng)生長(zhǎng)繁殖所必需；次生內(nèi)生菌在宿主內(nèi)既可垂直傳播也可水平傳播(Baumann, 2005；Oliveretal., 2010)，不是昆蟲(chóng)宿主生長(zhǎng)所必需的。在自然界進(jìn)化過(guò)程中，內(nèi)生菌與宿主昆蟲(chóng)互利共生(Wilkinson, 1998；Oliveretal., 2010)。內(nèi)生菌在宿主消化、生長(zhǎng)繁殖和行為中起著重要的作用(楊義婷等，2014)，昆蟲(chóng)體內(nèi)的某些共生菌能夠?yàn)樗拗魈峁┦澄镏兴狈Φ闹饕獱I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，消化食物以調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)平衡(王蔭長(zhǎng)，1994；呂仲賢等，2001)。

以昆蟲(chóng)為宿主的內(nèi)生菌能夠在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)、繁殖，從而昆蟲(chóng)共生菌也會(huì)因昆蟲(chóng)定殖環(huán)境的改變發(fā)生改變。將昆蟲(chóng)體內(nèi)內(nèi)生菌分離出來(lái)的方法有傳統(tǒng)分離法和分子生物學(xué)的方法。傳統(tǒng)分離法主要是通過(guò)劃線的方法分離可培養(yǎng)的微生物，而環(huán)境中有大部分微生物是不可培養(yǎng)的(Hanetal., 2015)，因此可通過(guò)分子生物學(xué)的方法獲得昆蟲(chóng)體內(nèi)內(nèi)生菌的一些數(shù)據(jù)。以分子生物學(xué)作為手段，昆蟲(chóng)共生菌的基因組DNA做模板，將PCR擴(kuò)增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，得到其微生物數(shù)量、種屬、區(qū)系組成及群落組成以及微生物與周圍自然條件相互影響的關(guān)系體系(Amannetal., 1995)。16S rRNA分為可變區(qū)和保守區(qū)，每一種細(xì)菌的保守區(qū)都相同，可以反映物種之間的親緣關(guān)系；而可變區(qū)因細(xì)菌的種類而有差異，可通過(guò)可變區(qū)了解物種之間的差異。有研究表明通過(guò)構(gòu)建白蟻腸道16S rDNA文庫(kù)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其腸道共生菌物種具有豐富性、多樣性，其中有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、螺旋體門等細(xì)菌(Zengetal., 2015)。因此，通過(guò)16S rDNA Miseq高通量測(cè)序技術(shù)(high throughput sequencing)(Koboldtetal., 2013)的方法分析研究昆蟲(chóng)體內(nèi)微生物的多樣性，為進(jìn)一步明確昆蟲(chóng)內(nèi)生菌生理功能和生態(tài)學(xué)意義具有重要的參考價(jià)值。

紅火蟻1齡、2齡、3齡幼蟲(chóng)咽部能過(guò)濾掉直徑大于0.88 μm的食物，只能消化育幼蟻反芻的液體食物。而4齡幼蟲(chóng)能夠取食直徑為45.8 μm，甚至較大的固體顆粒(Michael Glanceyetal., 1981)。固體食物必須經(jīng)過(guò)4齡幼蟲(chóng)消化后，再通過(guò)育幼蟻交哺飼喂給蟻后及低齡幼蟲(chóng)，從而為整個(gè)蟻群提供蛋白質(zhì)、油脂類及碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而維持整個(gè)蟻群的正常發(fā)育(Tschinkel, 1995；Vinson, 1997)。因此在整個(gè)蟻巢中，4齡幼蟲(chóng)對(duì)紅火蟻群落的生存尤為重要。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)紅火蟻幼蟲(chóng)腸道菌菌群的研究較少，而國(guó)外早有研究發(fā)現(xiàn)紅火蟻4齡幼蟲(chóng)的中腸是封閉的，在蛹期之前會(huì)排盡腸道內(nèi)容物(Petralia and Vinson, 1980)，但是對(duì)紅火蟻中腸可培養(yǎng)細(xì)菌知之甚少，前人的研究主要集中在尚未培養(yǎng)的專性共生體上(Peloquinetal., 2001)，直到2003年有研究者才證實(shí)了紅火蟻4齡幼蟲(chóng)中腸道確實(shí)有細(xì)菌(Peloquin and Greenberg, 2003)。Medina等嘗試使用SEM和TEM發(fā)現(xiàn)紅火蟻的腸道共生菌(Medinaetal., 2007)。Lee等分別取不同的3個(gè)地點(diǎn)的紅火蟻的4齡幼蟲(chóng)測(cè)其16S rRNA基因，發(fā)現(xiàn)3個(gè)地點(diǎn)的紅火蟻4齡幼蟲(chóng)內(nèi)共生菌并沒(méi)有緊密的關(guān)系，證實(shí)紅火蟻幼蟲(chóng)內(nèi)生菌菌群由所吃的食物決定(Leeetal., 2008)。

因?yàn)槔ハx(chóng)腸道內(nèi)共生菌通常處于平衡狀態(tài)，并受其昆蟲(chóng)宿主的控制，但如果被人為干擾，就會(huì)破壞這一平衡從而對(duì)宿主有機(jī)體致病。該研究的最初目的就是找到4齡幼蟲(chóng)的某一腸道可培養(yǎng)共生菌，人為干擾其表達(dá)從而達(dá)到生物防治的目的。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用紅火蟻來(lái)自廣州番禺，在野外挖取整個(gè)蟻巢裝入塑料桶(35.5 cm×34.8 cm)中帶回實(shí)驗(yàn)室在控制條件下(25±1℃, RH 70%±5%，L ∶D=8 ∶16)飼養(yǎng)，塑料桶內(nèi)壁涂抹福隆(AGC Chemicals Europe, Ltd., Thornton-Cleveleys, Lancashire, UK)以防螞蟻逃逸。所有的蟻巢都為由大量工蟻、有翅蟻、各階段的幼蟲(chóng)及蛹組成，飼喂方法參考Li等方法(Lietal., 2016)，待蟻群穩(wěn)定后將紅火蟻利用滴水法(呂利華等，2006)從土壤中分離供試驗(yàn)所需幼蟲(chóng)。分離出來(lái)的紅火蟻放入底部鋪有1 cm后石膏的塑料盒(28 cm×17 cm×18 cm)中備用，塑料盒的周圍涂有福隆。

1.2 樣品總DNA提取

在體視顯微鏡下分別挑選出3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)各20頭，用液氮速凍，放于-80℃冰箱備用。經(jīng)體表消毒后，按照OMEGA Insect DNA Isolation Kit (OMEGA，USA)的說(shuō)明書(shū)提取樣品中的總DNA。

1.3 高通量測(cè)序

采用細(xì)菌通用引物338 F和806 R對(duì)16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃，5 min；30×(94℃，30 s；60℃，30 s；72℃，1 min)；72℃，10 min。擴(kuò)增體系(20 μL)為：2×Taq Master Mix(Dye Plus)10 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、DNA模板10 ng(Longetal., 2010)。采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的MiSeq PE300測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Illumina MiSeq得到的數(shù)據(jù)是雙端序列，首先根據(jù)PE讀長(zhǎng)之間的部分重疊關(guān)系，將成對(duì)的讀長(zhǎng)拼接成一條序列，同時(shí)對(duì)讀長(zhǎng)的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和primer序列區(qū)分樣品得到的有序序列，并校正序列方向。采用軟件Trimmomatic和FLASH對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜(Chenetal., 2016)。通過(guò)Usearch軟件平臺(tái)(version 7.1 http://drive5.com/uparse)對(duì)OTU(Yeetal., 2017)進(jìn)行聚類，獲得OTU的代表序列。將所有優(yōu)化序列至OTU的代表序列，選出與OTU代表序列相似性大于等于97%的序列，生成OTU表格。為了得到每一個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，通過(guò)貝葉斯算法對(duì)相似水平的OTU高于97%的代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個(gè)分類學(xué)水平上分別統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。比對(duì)分類采用Silva(Release 128 http://www.arb-silva. de)數(shù)據(jù)庫(kù)(Yunetal., 2014)。通過(guò)Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析研究微生物群落的差異?；诟鞣诸悓W(xué)水平樣本序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表，利用R語(yǔ)言工具作圖分析不同樣本在各分類水平(如域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU等)上的群落結(jié)構(gòu)組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)的樣品序列經(jīng)拼接、質(zhì)控和過(guò)濾后分別得到44 390和51 559條序列，將序列相似性為97%的歸為1個(gè)OTU，2個(gè)樣品中總OTU數(shù)目為183，3齡幼蟲(chóng)的OTU數(shù)目為51，4齡幼蟲(chóng)的OTU數(shù)目為170。

2.2 稀釋曲線分析

稀釋曲線(Rarefaction curve)可以反應(yīng)不同樣品的測(cè)序深度。它也可以用來(lái)比較不同樣本中物種的豐富度、均一性。隨著隨機(jī)抽取測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果比較合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生極少新的OTU。兩樣品的稀釋曲線隨著測(cè)序深度的增加逐漸趨于平緩，表明測(cè)序覆蓋率較高(圖1)。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of all samples注：F2為4齡幼蟲(chóng)，F(xiàn)3為3齡幼蟲(chóng)。下同。Note: F2 was fourth instar larvae, F3 was third instar larvae. Same below.

2.3 3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)的Venn圖分析

3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)樣品共有的OTU數(shù)目為38，而3齡幼蟲(chóng)樣品獨(dú)有的OTU數(shù)目為13，4齡幼蟲(chóng)樣品獨(dú)有的OTU為132。兩樣品中的細(xì)菌只有少部分相似，4齡幼蟲(chóng)樣品中的細(xì)菌種類比3齡幼蟲(chóng)樣品中的細(xì)菌種類更豐富；其中3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)樣品的細(xì)菌種類分別占兩樣本所有細(xì)菌種類的27.87%、92.90%(圖2)。

圖2 細(xì)菌物種組成的Venn圖Fig.2 Venn diagram of bacterial species composition注：A, 4齡幼蟲(chóng)樣品F2; B, 3齡幼蟲(chóng)樣品F3。Note: A, Fourth instar larvae sample F2; B, Third instar larvae sample F3.

2.4 3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)門水平的Alpha多樣性分析

本次各樣本測(cè)序結(jié)果覆蓋率均大于99.95%。4齡幼蟲(chóng)的物種豐度和物種多樣性顯著高于3齡幼蟲(chóng)(表1)。

表1 樣品多樣性指數(shù)表

2.5 3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)的物種組成分析

高通量測(cè)序結(jié)果表明，在門、綱、目、科、屬5個(gè)細(xì)菌分類學(xué)水平上，3齡幼蟲(chóng)比4齡幼蟲(chóng)物種豐富度低(表2)。

表2 樣品在各分類水平的物種分布

2.5.1門水平樣品物種分布

3齡幼蟲(chóng)主要由9個(gè)門組成，包括軟壁菌門Tenericutes(95.11%)、變形菌門Proteobacteria(4.75%)等，其優(yōu)勢(shì)種群為軟壁菌門(圖3)。4齡幼蟲(chóng)主要由14個(gè)門組成，包括變形菌門Proteobacteria(93.78%)、放線菌門Actinobacteria(2.08%)、擬桿菌門Bacteroidetes(1.93%)、厚壁菌門Firmicutes(1.85%)等。其優(yōu)勢(shì)種群為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門(圖3)。而2個(gè)齡期共有的是硝化螺旋菌門Nitrospirae，由于占有的比例很低，被歸為others。

圖3 不同齡期門水平物種分布Fig.3 Species distribution at phylum level in different instar

2.5.2綱水平樣品物種分布

3齡幼蟲(chóng)主要由11個(gè)綱組成，包括柔膜菌綱Mollicutes(95.11%)、γ-變形菌綱Gamma Proteobacteria(0.27%)、α-變形菌綱Alpha Proteobacteria等。其優(yōu)勢(shì)菌群為柔膜菌綱(圖4)。4齡幼蟲(chóng)主要由22個(gè)綱組成，包括γ-變形菌綱Gamma Proteobacteria(92.58%)、α-變形菌綱Alpha Proteobacteria(1.16%)、放線菌綱Actinobacteria(2.08%)、擬桿菌綱Bacteroidia(1.93%)等。其優(yōu)勢(shì)菌群為γ-變形菌綱、α-變形菌綱和放線菌綱(圖4)。

圖4 不同齡期綱水平物種分布Fig.4 Species distribution at class level in different instar

2.5.3目水平樣品物種分布

3齡幼蟲(chóng)主要由23個(gè)目組成，包括蟲(chóng)原體目Entomoplasmatales(95.11%)、根瘤菌目Rhizobiales(4.46%)等。其優(yōu)勢(shì)菌群為蟲(chóng)原體目(圖5)。4齡幼蟲(chóng)主要由51個(gè)目組成，包括腸桿菌目Enterobacteriales(77.88%)、假單胞目Pseudomonadales(7.27%)、黃單胞菌目Xanthomonadales(6.09%)、根瘤菌目Rhizobiales(0.71%)、Flavobacteriales(1.54%)、β-變形桿菌目(1.08%)等。其優(yōu)勢(shì)菌群為腸桿菌目、假單胞目和黃單胞菌目(圖5)。

圖5 不同齡期目水平物種分布Fig.5 Species distribution at order level in different instar

2.5.4科水平樣品物種分布

3齡幼蟲(chóng)主要由32個(gè)科組成，包括蟲(chóng)原體科Entomoplasmataceae(95.11%)、根瘤菌科Rhizobiaceae(4.46%)等。其優(yōu)勢(shì)菌群為蟲(chóng)原體科(圖6)。4齡幼蟲(chóng)主要由94個(gè)科組成，包括腸桿菌科Enterobacteriaceae(77.88%)、莫拉菌科Moraxellaceae(6.62%)、黃單胞菌科Xanthomonadaceae(6.09%)、Weeksellaceae(1.53%)、伯克氏菌科Burkholderiacea(1.07%)。其優(yōu)勢(shì)菌群為腸桿菌科、莫拉菌科和黃單胞菌科(圖6)。

圖6 不同齡期科水平物種分布Fig.6 Species distribution at family level in different instar

2.5.5屬水平樣品物種分布

3齡幼蟲(chóng)主要由44個(gè)屬組成，包括支原菌屬M(fèi)ycoplasma(95.11%)、中慢生根瘤菌屬M(fèi)esorhizobium(4.45%)等。其優(yōu)勢(shì)菌群為支原菌屬(圖7)。4齡幼蟲(chóng)主要由139個(gè)屬組成，包括腸桿菌屬Enterobacter(37.10%)、預(yù)研菌屬Yokenella(26.79%)、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter(6.62%)、沙雷氏菌屬Serratia(6.36%)、泛菌屬Pantoea(6.35%)、Vulcaniibacterium(5.48%)等。其優(yōu)勢(shì)菌群為腸桿菌屬、預(yù)研菌屬、不動(dòng)桿菌屬和沙雷氏菌屬(圖7)。

圖7 不同齡期屬水平物種分布Fig.7 Species distribution at genus level in different instar

3 結(jié)論與討論

本研究采用16S rDNA V3+V4高變區(qū)的Illumina Miseq高通量測(cè)序法對(duì)紅火蟻3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)微生物多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析，初步揭示了紅火蟻3齡幼蟲(chóng)與4齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)組成的差異性。

但是，Illumina Miseq高通量測(cè)序只能將紅火蟻3齡和4齡幼蟲(chóng)的腸道菌注釋到屬水平上，主要是由于高通量測(cè)序可同時(shí)在數(shù)百萬(wàn)個(gè)點(diǎn)上讀長(zhǎng)，不可能對(duì)16S rRNA的所有可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，通常只選擇在450～550 bp之間作為一個(gè)測(cè)序區(qū)域，因此導(dǎo)致后續(xù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析時(shí)，對(duì)物種注釋的分辨度降低。

通過(guò)Venn圖分析、Alpha多樣性分析及細(xì)菌多樣性分析等分析方法，對(duì)紅火蟻的3齡幼蟲(chóng)和4齡幼蟲(chóng)2個(gè)階段的腸道細(xì)菌群落差異性分析，結(jié)果表明紅火蟻幼蟲(chóng)2個(gè)不同發(fā)育階段腸道菌群的分布存在較大的差異性。紅火蟻3齡、4齡幼蟲(chóng)腸道菌群包括183個(gè)OTU，歸屬于15個(gè)門、24個(gè)綱、56個(gè)目、101個(gè)科、151個(gè)屬，其中3齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)微生物的OUT數(shù)目只有51個(gè)，而4齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)微生物的OUT數(shù)目有170個(gè)，該結(jié)果表明4齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)微生物的物種多樣性及物種豐富度高于 3齡幼蟲(chóng)，引起該差異的主要原因可能是4齡幼蟲(chóng)是整個(gè)蟻巢蛋白質(zhì)及能量的主要供給者，4齡幼蟲(chóng)消化固體食物后反芻給保育蟻，保育蟻再飼喂蟻后及其它蟻型(Whitworthetal., 1998; Yunetal., 2014)。紅火蟻幼蟲(chóng)共有4個(gè)齡期，因3齡幼蟲(chóng)和1齡、2齡幼蟲(chóng)的取食習(xí)性相同，為了比較不同取食習(xí)性幼蟲(chóng)間腸道內(nèi)細(xì)菌的差異，本研究只選取4齡和3齡兩個(gè)齡期的幼蟲(chóng)做為實(shí)驗(yàn)材料。而紅火蟻幼蟲(chóng)的其它齡期及其各個(gè)發(fā)育階段腸道微生物的差異本實(shí)驗(yàn)室下一步會(huì)繼續(xù)研究分析。

通過(guò)16S rDNA高通量測(cè)序的方法研究發(fā)現(xiàn)，3齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為軟壁菌門的支原菌屬，比例達(dá)到95.11%，而紅火蟻4齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門的7個(gè)屬，比例達(dá)到93.78%，其中優(yōu)勢(shì)菌屬為腸桿菌屬，比例達(dá)到37.10%，有研究表明，腸桿菌屬與昆蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)消化有密切關(guān)系。表明2個(gè)樣本內(nèi)細(xì)菌群落的差異較大。昆蟲(chóng)腸道菌結(jié)構(gòu)組成的主要優(yōu)勢(shì)菌集中在變形菌門和厚壁菌門，并且雜食性昆蟲(chóng)比單一食性昆蟲(chóng)腸道菌群豐富度更高(Yunetal., 2014)。這一結(jié)論與本文的研究結(jié)果相符，因?yàn)榧t火蟻4齡幼蟲(chóng)獲得的食物種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)豐富于其它蟲(chóng)齡，因此腸道內(nèi)應(yīng)具有更加豐富的菌群，從而為紅火蟻的營(yíng)養(yǎng)供給提供保證，具體每種菌的功能值得下一步研究。

許多因素可能影響腸道共生菌的存在和數(shù)量，包括飲食、年齡、疾病狀態(tài)和行為(Dillon and Dillon, 2004)。在昆蟲(chóng)的不同發(fā)育階段，體內(nèi)菌群的物種豐富度會(huì)有一定的差異，不同發(fā)育齡期的內(nèi)生菌多樣性也有所差異。在社會(huì)性昆蟲(chóng)中，成蟲(chóng)羽化后的營(yíng)養(yǎng)和微生物演替速率可能是影響種群健康的重要變量(Andersonetal., 2011)。本研究結(jié)果表明，紅火蟻4齡幼蟲(chóng)腸道菌菌群物種豐富度及多樣性均大于3齡幼蟲(chóng)，其原因可能是由于紅火蟻不同齡期的幼蟲(chóng)其在蟻巢中的分工不同而引起腸道菌菌群物種豐富度的差異；也可能是是由于受宿主生存環(huán)境的影響。昆蟲(chóng)腸道結(jié)構(gòu)影響菌群群落組成，腸道的微環(huán)境有所差異，因此不同的腸道位置具有不同的微生物。在脊椎動(dòng)物中，某些微生物的定殖可以顯著改變?nèi)郝涞慕M成，而群落對(duì)抑制病原體定殖的能力被認(rèn)為是本地昆蟲(chóng)腸道微生物群最重要的功能(Leeetal., 2008)。

昆蟲(chóng)體內(nèi)存在大量可培養(yǎng)與不可培養(yǎng)的微生物，在自然界的進(jìn)化過(guò)程中微生物與寄主形成了密切的互利共生關(guān)系，在昆蟲(chóng)的整個(gè)生活周期中起重要的作用。Lee等人研究發(fā)現(xiàn)，紅火蟻腸道細(xì)菌來(lái)自于其所生存的環(huán)境，4齡幼蟲(chóng)的腸道細(xì)菌存在是因?yàn)樗鼈內(nèi)∈沉藥в屑?xì)菌的食物(Lee and Hooper-Bùi, 2012)。然而，本研究發(fā)現(xiàn)具有相同食物來(lái)源的4齡幼蟲(chóng)與3齡幼蟲(chóng)的微生物種類明顯不同，4齡幼蟲(chóng)腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門的7個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌屬為腸桿菌屬，而腸桿菌屬與昆蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)消化密切相關(guān)，因此紅火蟻在吸收營(yíng)養(yǎng)時(shí)是否對(duì)自身消化有關(guān)的細(xì)菌具有一定的選擇性有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。Whitworth等人從4齡幼蟲(chóng)中純化和鑒定了4種蛋白酶，發(fā)現(xiàn)卵、預(yù)蛹、蛹和成蟲(chóng)沒(méi)有這些蛋白酶，而1齡、2齡和3齡幼蟲(chóng)的酶活性明顯低于4齡幼蟲(chóng)(Whitworthetal., 1998)。4齡幼蟲(chóng)對(duì)紅火蟻群落的生存最為重要，因?yàn)樗粌H是用于消化固體食物酶的單一來(lái)源，而且是與群落其余蟲(chóng)態(tài)共享消化物質(zhì)的獨(dú)特來(lái)源(Vinson and Sorensen, 1986)。因此這些酶很可能參與了紅火蟻群落對(duì)食物的消化，這些酶與腸桿菌的關(guān)系也值得進(jìn)一步研究。有研究表明，白蟻腸道共生菌的消除，可使白蟻在短期內(nèi)死亡，反映了腸道共生菌對(duì)白蟻的生命必然有著某種重要作用(Xiang and Zhou, 2009)。也有研究表明，使用美洲大蠊喂食抗生素后，其腸道菌群被消除，導(dǎo)致宿主的代謝速率減慢且體重降低，說(shuō)明腸道微生物能為宿主提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Ondrejech, 2016)。本研究通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序手段對(duì)紅火蟻4齡幼蟲(chóng)與3齡幼蟲(chóng)2個(gè)階段腸道菌菌群的群落結(jié)構(gòu)組成差異進(jìn)行初步分析，可為下一步研究各個(gè)齡期及蟻型的腸道內(nèi)生菌菌群的差異奠定基礎(chǔ)，最終為紅火蟻的生物防治提供新的思路及方法。