丁 杰，溫勝芳，王雪婷，薛燕楠，張國福，金 巖，夏曉明*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271000；2. 山東省農(nóng)藥檢定所，濟(jì)南 251000)

灰飛虱(small brown planthopper，SBPH)Laodelphaxstriatellus(Fallén)屬半翅目飛虱科，主要分布在亞洲和歐洲的溫帶和亞熱帶地區(qū)，在我國長(zhǎng)江流域和黃淮地區(qū)為害嚴(yán)重?；绎w虱世代周期短，1年可發(fā)生5～6代，各世代可在不同寄主間轉(zhuǎn)移危害，除取食水稻外，還可危害麥類、玉米等禾本科植物，同時(shí)田間禾本科雜草也可以為灰飛虱提供充足的營養(yǎng)條件(汪恩國，2007；喬慧等，2009)。灰飛虱除直接為害造成損失以外，主要傳播水稻條紋葉枯病(rice stripe virus, RSV)和黑條矮縮病(rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)等病毒病而造成水稻、小麥和玉米產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失(Otukaetal.，2010；Zhangetal.，2010)。

由于寄主植物體內(nèi)的次生物質(zhì)對(duì)植食性昆蟲體內(nèi)的解毒酶具有誘導(dǎo)作用(王沫等，2003)，同時(shí)不同寄主所含有的營養(yǎng)成分和次生代謝物質(zhì)不同，所以當(dāng)昆蟲取食不同寄主植物時(shí)，其體內(nèi)的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和多功能氧化酶(MFO)等解毒酶活性會(huì)發(fā)生變化(呂朝軍等，2007；李曉磊和劉長(zhǎng)明，2009；張睿等，2011；尹飛等，2013；Dermauwetal.，2018)。當(dāng)昆蟲以不同寄主植物為食時(shí)，會(huì)影響昆蟲體內(nèi)這些酶的活性以擴(kuò)大寄主植物范圍(Wangetal.，2010)。除酶活外，昆蟲解毒酶基因的表達(dá)水平也受不同寄主植物的影響，且因寄主植物種類而異(Huangetal.，2018；Daietal.，2019)。害蟲體內(nèi)參與植物次生物質(zhì)代謝和對(duì)殺蟲劑起解毒作用的酶系是相同或相似的(姚洪渭等，2002；謝佳燕等，2007)，因此，寄主植物介導(dǎo)的解毒酶基因表達(dá)和解毒植物次生代謝物和化感物質(zhì)所涉及的酶活性的變化可能影響昆蟲的適應(yīng)性，并影響昆蟲對(duì)殺蟲劑的敏感性(Taoetal.，2012)。并在小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(尹飛等，2013)、斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius(Xueetal.，2010；Karuppaiahetal.，2016)、B型煙粉虱BemisiatabaciGennadius(Castleetal.，2009；Xieetal.，2011)、朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus(戴宇婷，2013)等多種害蟲中得到證實(shí)。

為探索取食不同寄主植物對(duì)灰飛虱的影響，本研究選取了灰飛虱的常見寄主水稻(紫香糯2315和武育粳3號(hào))、小麥(農(nóng)大26和濟(jì)麥22)及稗草，將灰飛虱在這5種寄主上連續(xù)飼養(yǎng)3代后，測(cè)定了其對(duì)不同藥劑的敏感性以及常見解毒酶活性的變化。研究結(jié)果可為灰飛虱的抗性發(fā)展研究提供依據(jù)，并為灰飛虱的田間科學(xué)用藥和綜合治理策略的制定提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

灰飛虱種群2017年5月采集自山東省魚臺(tái)縣水稻良種繁育基地的小麥田，于RXZ智能型人工氣候培養(yǎng)箱中，在塑料盒(35 cm×25 cm×15 cm)中用未接觸農(nóng)藥的紫香糯2315水稻飼養(yǎng)繁殖。水稻苗每10～15 d更換一次，以確保灰飛虱可以獲得充足的營養(yǎng)。試驗(yàn)進(jìn)行之前灰飛虱已在實(shí)驗(yàn)室在不接觸藥劑的條件下飼養(yǎng)20代以上。飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃，相對(duì)濕度75%±5%，光周期L ∶D=16 h ∶8 h。

1.2 供試寄主植物

供試5種寄主植物包括2個(gè)水稻OryzasativaL.品種(紫香糯2315和武育粳3號(hào))，由山東省水稻研究所提供；2個(gè)小麥TriticumaestivumL.品種(農(nóng)大26和濟(jì)麥22)，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供；1種禾本科雜草：稗草EchinochloacrusgalliBeauv.，采自山東省魚臺(tái)縣水稻良種繁育基地。5種寄主植物均為灰飛虱的常見寄主。將灰飛虱分別轉(zhuǎn)接到供試的5種寄主植物上，按照1.1的飼養(yǎng)條件連續(xù)飼養(yǎng)3代后，選取3齡灰飛虱若蟲進(jìn)行藥劑敏感性和解毒酶活性測(cè)定。

1.3 供試藥劑及試劑

94%溴氰蟲酰胺原藥(cyantraniliprole，上海杜邦農(nóng)化有限公司)，96.4%吡蟲啉原藥(imidacloprid，山東濰坊潤豐化工股份有限公司)，96%噻蟲嗪原藥(thiamethoxam，山東濰坊潤豐化工股份有限公司)，10%三氟苯嘧啶懸浮劑(triflumezopyrim，美國杜邦公司)，丙酮(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，α-乙酸萘酯(α-NA)(上海麥克林生化科技有限公司)，固藍(lán)RR鹽(上海麥克林生化科技有限公司)，對(duì)硝基苯甲醚(p-NA)(上海麥克林生化科技有限公司)，1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB)(上海麥克林生化科技有限公司)，還原型谷胱甘肽(GSH)(北京索萊寶科技有限公司)，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)(北京索萊寶科技有限公司)，NaH2PO4(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，Na2HPO4(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)(Amresco公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)(BBI公司)，苯基硫脲(PTU)(北京精細(xì)化工廠)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀 680 型(Bio-Rad 公司)、Neofuge 13 R高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 生物測(cè)定

參照班蘭鳳等(2015)和張凱倫等(2020)報(bào)道的稻苗浸漬法。用丙酮(10%三氟苯嘧啶懸浮劑用去離子水稀釋)將供試藥劑溶解，配制成1×104mg/L的母液。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將上述母液用0.1%吐溫80依次稀釋成一系列濃度。將6日齡左右的水稻苗連根一起在系列濃度的藥液中浸10～15 s，取出瀝至無液體滴下，自然晾干后以濕脫脂棉包住根部放入透明的試管中。用吸蟲器將試蟲移入試管(2 cm×20 cm)中，每管15頭，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，共45頭，然后用紗布封口，以防濕度過大增加死亡率和灰飛虱逃逸。待試蟲全部爬上稻苗或試管壁后，剔除機(jī)械損傷的個(gè)體，并補(bǔ)足15頭。接蟲后把試管放入溫度27±1℃，光周期為16 h ∶8 h(光照 ∶黑暗)的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。處理3 d后，檢查死蟲數(shù)，以不含藥劑的處理做空白對(duì)照。

1.5 酶活測(cè)定

1.5.1酶液制備

取不同寄主上的3齡灰飛虱若蟲20頭，用1 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH7.6，含1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L PTU和20% 甘油)冰浴勻漿，于4℃，10 000 rpm條件下離心15 min，上清液即待測(cè)酶液。

1.5.2酯酶(esterases，ESTs)活力測(cè)定

參照Han等(1998)的方法，并略做修改。將20 mg固藍(lán)RR鹽和0.2 mL 100 mmol/L α-乙酸萘酯(α-NA)加入到10 mL 0.2 mol/L, pH6.0的磷酸緩沖液中，振蕩混勻，過濾得到底物和顯色劑的混合液。在96孔酶標(biāo)板中每孔加入20 μL經(jīng)0.1 mol/L pH7.6磷酸緩沖液稀釋10倍的酶液和200 μL底物和顯色劑的混合液。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm下記錄光密度值，酶促反應(yīng)在27℃下進(jìn)行，每隔30 s記錄一次，反應(yīng)15 min。

1.5.3谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferases，GSTs)活力測(cè)定

參照Kao等(1989)的方法。在96孔酶標(biāo)板中每孔加入50 μL 0.6 mmol/L 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和100 μL 6 mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)，最后加入100 μL酶液。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)340 nm下記錄光密度值，酶促反應(yīng)在27℃下進(jìn)行，每隔20 s記錄一次，反應(yīng)15 min。

1.5.4多功能氧化酶(mixed-function oxidase，MFO)活力測(cè)定

參考Shang and Soderlund(1984)的方法。在96孔酶標(biāo)板中每孔加入50 μL 1.0 mmol/L 對(duì)硝基苯甲醚(p-NA)和50 μL 1.0 mmol/L還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，最后加入100 μL酶液。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405 nm下記錄光密度值，酶促反應(yīng)在27℃下進(jìn)行，每隔20 s記錄一次，反應(yīng)15 min。

1.5.4蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出供試藥劑對(duì)不同寄主上的灰飛虱的毒力回歸方程式、LC50值及其95%置信限、b值及其標(biāo)準(zhǔn)誤，并采用Tukey’s test比較不同寄主植物上灰飛虱的解毒酶活性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 取食不同寄主植物灰飛虱對(duì)藥劑敏感性的影響

采用稻苗浸漬法，測(cè)定取食不同寄主植物的灰飛虱3齡若蟲對(duì)三氟苯嘧啶、吡蟲啉、噻蟲嗪和溴氰蟲酰胺的敏感性，結(jié)果見表1。從表1可以看出，連續(xù)取食不同寄主植物3代后，灰飛虱3齡若蟲對(duì)三氟苯嘧啶的敏感性無差異，但對(duì)吡蟲啉、噻蟲嗪和溴氰蟲酰胺的敏感性存在一定差異。其中，取食2個(gè)品種小麥的灰飛虱對(duì)吡蟲啉和溴氰蟲酰胺最敏感，取食2個(gè)水稻品種和稗草的灰飛虱對(duì)吡蟲啉和溴氰蟲酰胺敏感性相對(duì)較低。取食水稻武育粳3號(hào)的灰飛虱對(duì)噻蟲嗪最敏感；取食2個(gè)品種小麥的灰飛虱對(duì)噻蟲嗪相對(duì)較敏感，取食稗草和水稻紫香糯2315的灰飛虱對(duì)噻蟲嗪敏感性最低。

表1 取食不同寄主的灰飛虱對(duì)4種殺蟲劑的敏感性

2.2 取食不同寄主植物灰飛虱的解毒酶活性比較

連續(xù)取食不同寄主植物3代后，灰飛虱3齡若蟲體內(nèi)的3種解毒酶活性存在明顯差異(表2)。取食稗草的灰飛虱解毒酶活性要明顯高于取食小麥的灰飛虱解毒酶活性。其中，取食稗草的MFO和ESTs活性均最高，取食2個(gè)品種小麥的MFO和ESTs活性均最低；取食2個(gè)品種小麥的ESTs活性差異顯著，但MFO活性沒有差異，取食2個(gè)品種水稻的MFO和ETSs活性差異顯著(P<0.05)。GST活性從大到小依次為紫香糯2315>稗草>濟(jì)麥22>武育粳3號(hào)>農(nóng)大26，不同寄主之間差異顯著(P<0.05)。

表2 取食不同寄主灰飛虱的3種解毒酶活性

3 結(jié)論與討論

寄主植物誘導(dǎo)的昆蟲對(duì)藥劑敏感性變化通常有3種情況：敏感性上升、下降或基本保持不變(Wangetal.，2010；Xueetal.，2010)。已有研究發(fā)現(xiàn)，取食不同寄主后的朱砂葉螨對(duì)聯(lián)苯菊酯的敏感性無變化(戴宇婷等，2013)。本研究也發(fā)現(xiàn)，連續(xù)取食水稻、小麥和雜草3代后，灰飛虱3齡若蟲對(duì)三氟苯嘧啶的敏感性無變化，對(duì)吡蟲啉、噻蟲嗪和溴氰蟲酰胺的敏感性變化也較小。但也有很多研究表明，取食不同寄主植物后，害蟲對(duì)藥劑的敏感性變化較大(Karuppaiahetal.，2016)。這種變化與寄主植物的營養(yǎng)條件、次生代謝物質(zhì)的種類和含量、昆蟲種類與發(fā)育階段以及外界環(huán)境溫度等條件有關(guān)(姚洪渭等，2002；張睿，2011)，與供試藥劑的種類也有關(guān)系(Xieetal.，2011)。本研究也發(fā)現(xiàn)，取食不同寄主植物后灰飛虱對(duì)不同藥劑敏感性變化也存在不同。此外，誘導(dǎo)時(shí)間較短，這可能是寄主植物對(duì)灰飛虱藥劑敏感性影響較小的一個(gè)原因。

寄主植物在影響害蟲生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)也可以誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)的解毒酶系統(tǒng)發(fā)生變化(呂朝軍等，2007；呂敏等，2012)。ESTs、GSTs和MFO均是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶，能夠被不同寄主植物誘導(dǎo)，在對(duì)次生代謝物質(zhì)和外源化合物的解毒代謝和對(duì)殺蟲劑的抗性機(jī)制中起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，用不同寄主植物飼養(yǎng)灰飛虱3代后，灰飛虱3齡若蟲體內(nèi)的ESTs、GSTs和MFO 3種解毒酶活性存在明顯差異，取食稗草后的灰飛虱體內(nèi)3種解毒酶活性要明顯高于取食小麥的灰飛虱。盡管發(fā)現(xiàn)取食不同寄主植物后的灰飛虱對(duì)藥劑的敏感性變化較小，但取食小麥后的灰飛虱對(duì)藥劑的敏感性均要高于稗草的趨勢(shì)。因此，這種變化趨勢(shì)很可能是不同次生代謝物質(zhì)誘導(dǎo)解毒酶活性變化導(dǎo)致。但是哪種解毒代謝酶起主要作用，還需進(jìn)一步研究。

在包括中國的東亞地區(qū)，小麥和水稻輪作系統(tǒng)中的小麥、水稻和雜草均可為灰飛虱提供足夠的食物(Huangetal.，2018；Lietal.，2019)。本研究結(jié)果表明，取食水稻、小麥和稗草后的灰飛虱的解毒酶活性存在差異，同時(shí)灰飛虱對(duì)殺蟲劑的敏感性也發(fā)生了一定的變化。研究結(jié)果不僅對(duì)灰飛虱的田間綜合防治具有重要的意義，也有助于我們更好的理解灰飛虱對(duì)寄主植物的生理生化適應(yīng)機(jī)制。