卜文超,郭 虹,陳世新,曾憲智,湯挺兵,關(guān)云茜

(麗水學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院;2.炎癥相關(guān)疾病研究所,浙江 麗水 323000)

根據(jù)最新研究顯示,肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,肺癌在中國(guó)男性中發(fā)病率居惡性腫瘤的首位,女性肺癌患者發(fā)病率僅次于乳腺癌患者[1]。根據(jù)其臨床病理組織學(xué)分型可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞癌(NSCLC)。NSCLC約占肺癌患者總數(shù)的85%,5年的生存率僅為15%[2],且NSCLC患者在疾病的晚期還會(huì)出現(xiàn)明顯癥狀[3]。盡管最近化療有所進(jìn)展,但NSCLC的治療效果極差。布魯頓酪氨酸激酶(bruton tyrosine kinase,BTK)是一種非受體激酶,屬于TEC家族酪氨酸激酶。近年來(lái)研究顯示BTK表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),BTK在致癌信號(hào)中起著至關(guān)重要的作用。BTK對(duì)于許多B細(xì)胞惡性腫瘤中白血病細(xì)胞增殖和存活至關(guān)重要[4]。BTK在幾種乳腺癌細(xì)胞系和腫瘤中表達(dá),過(guò)表達(dá)的BTK抑制阿霉素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡[5]。BTK在多種前列腺癌細(xì)胞系和腫瘤中表達(dá)升高[6]。然而目前BTK在NSCLC中的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程、作用機(jī)制和預(yù)后方面,鮮有較為系統(tǒng)化的報(bào)道。本研究利用Oncomine、GEPIA、Kaplan-Meier Plotter等數(shù)據(jù)庫(kù),基于高通量數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析BTK基因在NSCLC中的表達(dá)和臨床意義,以期發(fā)現(xiàn)NSCLC潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 BIOGPS數(shù)據(jù)庫(kù)分析BTK基因的表達(dá)情況應(yīng)用BIOGPS數(shù)據(jù)庫(kù)分析BTK基因在正常人體組織和不同類(lèi)型細(xì)胞的表達(dá)情況。

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析BTK基因在腫瘤中的表達(dá)利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析BTK基因在腫瘤中的異常表達(dá),并應(yīng)用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)二次分析BTK在NSCLC的表達(dá)情況。判斷BTK在哪些腫瘤中會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)。設(shè)置檢索條件為：BTK,并點(diǎn)擊檢索;二次綜合分析的檢索條件：(1)基因：BTK;(2)分析類(lèi)型：腫瘤VS正常;(3)腫瘤類(lèi)型：肺癌;(4)數(shù)據(jù)類(lèi)型：mRNA。默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)置的數(shù)值值,并根據(jù)臨界值(P-VALUE<1E-4,FOLD CHANGE≥2)內(nèi)設(shè)置的條件,在臨界值內(nèi)的數(shù)據(jù)集做二次分析。

1.3 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)分析BTK基因在NSCLC組織中的表達(dá)情況GIPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索條件設(shè)置為：(1)expression DIY:Boxplot;(2)Gene：BTK;(3)cancer name：LUAD and LUSC;(4)Matched Normal data：TCGA and GTEx,其余檢索條件按照默認(rèn)值。

1.4 利用CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)檢索BTK基因細(xì)胞系分析CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)檢索條件設(shè)置為：輸入BTK后點(diǎn)擊“檢索”。

1.5 K-M Plotter分析NSCLC患者的生存周期K-M Plotter的檢索條件設(shè)置為：(1)mRNA：lung cancer;(2)Gene：BTK(探針：205504_at);(3)Survival:OS/DFS。采用系統(tǒng)中BTK表達(dá)的中位數(shù),作為高表達(dá)組與低表達(dá)組分組依據(jù),其余檢索條件按照默認(rèn)值。利用K-M Plotter在線(xiàn)軟件分別分析BTK與NSCLC的生存分析,并分別分析其亞型LUAD和LUSC,其余檢索條件按照網(wǎng)站中的默認(rèn)值設(shè)置。

1.6 The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)本研究應(yīng)用The Human Protein Atlas網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)BTK特異性抗體(No:HPA002028)分析BTK蛋白在正常肺組織和NSCLC中的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法正常組織與NSCLC基因的表達(dá)差異采用t檢驗(yàn),不同數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)處理均采用該數(shù)據(jù)庫(kù)中自帶在線(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)的處理均以雙側(cè)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BTK基因在正常人體組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況通過(guò)BIOGPS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析可知,BTK在人體各個(gè)正常組織中廣泛表達(dá),在多種免疫細(xì)胞中高表達(dá),如在CD19+B淋巴細(xì)胞和CD14+單核巨噬細(xì)胞表達(dá)量相對(duì)較高,見(jiàn)圖1。

圖1 BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)中BTK基因在正常人體組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 BTK在不同腫瘤類(lèi)型中的表達(dá)情況Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)共收集362項(xiàng)不同癌癥組織芯片BTK的表達(dá)研究結(jié)果,其中17項(xiàng)表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在4項(xiàng)研究中BTK表達(dá)增高,13項(xiàng)研究中表達(dá)降低,其中BTK在結(jié)直腸癌、肺癌、肉瘤等腫瘤中表達(dá)降低,在乳腺癌中表達(dá)增高,見(jiàn)圖2A。根據(jù)檢索條件共得出3項(xiàng)研究符合,此研究文章發(fā)表在Genome Res[7]和PLoS One[8]雜志中。對(duì)3項(xiàng)研究共272例樣本進(jìn)行Mate分析,發(fā)現(xiàn)BTK在NSCLC中處于低表達(dá)狀態(tài),其P值為7.05E-10,見(jiàn)圖2B。

圖2 BTK基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)不同類(lèi)型腫瘤中的表達(dá)情況及其在NSCLC研究中的Meta分析

2.3 BTK mRNA在組織中的表達(dá)情況通過(guò)檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),BTK mRNA在LUAD和LUSC組織中的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05),表明BTK基因在LUSC(圖3A)和LUAD(圖3B)中處于低表達(dá)水平。

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中BTK在不同NSCLC研究芯片中的表達(dá)

2.4 CCLE對(duì)BTK進(jìn)行細(xì)胞系分析CCLE分析結(jié)果顯示,BTK在NSCLC細(xì)胞系中處于低表達(dá)狀態(tài),并且在37類(lèi)癌細(xì)胞中處于第26位(圖4)。

2.5 BTK基因表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系為明確BTK表達(dá)水平對(duì)NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系,使用K-M plotter數(shù)據(jù)進(jìn)行在線(xiàn)分析,共篩選出1926例不同類(lèi)型的肺癌組織樣本。K-M plotter分析結(jié)果顯示：BTK表達(dá)水平對(duì)NSCLC患者總體生存率(Overall Survival,OS)具有顯著影響,相較于高表達(dá)組,BTK低表達(dá)的患者OS顯著高于高表達(dá)組患者(P<0.05)(圖5A)。進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)：在肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)組織中BTK高表達(dá)患者OS顯著下調(diào)(P<0.05)(圖5B),而在肺鱗狀細(xì)胞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC)組織中BTK高表達(dá)組和低表達(dá)組OS未顯示出明顯的差異性(P>0.05)(圖5C)。

圖4 CCLE對(duì)BTK基因細(xì)胞系分析結(jié)果

圖5 BTK表達(dá)與NSCLC總生存期之間的關(guān)系

2.6 BTK蛋白在肺癌中的表達(dá)情況應(yīng)用The Human Protein Atlas網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)檢索BTK特異性抗體(No:HPA001198),分析BTK蛋白在正常肺組織和NSCLC中的表達(dá)情況。其中數(shù)據(jù)庫(kù)中有3例正常肺組織抗體染色為中等程度,其陽(yáng)性表達(dá)部位在肺組織巨噬細(xì)胞中,而肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞中未檢測(cè)到陽(yáng)性表達(dá)(圖6A)。在NSCLC組織樣本中,LUAD(圖6B)和LUSC(圖6C)的抗體染色均未檢測(cè)到其表達(dá)。

圖6 人類(lèi)蛋白圖譜項(xiàng)目中BTK蛋白在正常肺組織和NSCLC中的表達(dá)情況

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中位居首位。肺癌根據(jù)其臨床病理組織學(xué)分型,可分為SCLC和NSCLC。肺癌的治療方案包括放療、化療、手術(shù)和靶向治療。治療模式取決于癌癥的類(lèi)型和處于的病情階段,盡管隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展,其診斷和治療方式均有所改善,但肺癌的預(yù)后仍不盡人意,因此更好的了解NSCLC潛在的治療靶點(diǎn)和 預(yù)后的標(biāo)志物變得尤為重要[9],可為今后開(kāi)發(fā)更為有效和具體的藥物治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

BTK是一種非受體酪氨酸激酶,是Tec激酶家族。BTK是B細(xì)胞受體(BCR)、toll樣受體和Fc受體的下游信號(hào)分子[10]。BTK在致癌信號(hào)中起著重要作用,這對(duì)各種B細(xì)胞惡性腫瘤中的白血病細(xì)胞的生存尤為重要[11]。BTK小分子抑制劑依魯替尼是治療血液惡性腫瘤的藥物[12],然而依魯替尼在實(shí)體瘤中沒(méi)有達(dá)到較好診治效果,且BTK在NSCLC中少見(jiàn)較為系統(tǒng)的研究。

BIOGPS是一個(gè)基因?yàn)橹行牡拈T(mén)戶(hù)[13-14]。BIOGPS數(shù)據(jù)庫(kù)可顯示多種基因在正常組織和細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄情況,通過(guò)檢索BIOGPS數(shù)據(jù)庫(kù),BTK在正常肺組織中表達(dá)。Oncomin數(shù)據(jù)庫(kù)為癌癥微列陣數(shù)據(jù)庫(kù)和基于網(wǎng)絡(luò)挖掘平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù),可進(jìn)行不同腫瘤亞型與正常組織之間進(jìn)行差異表達(dá)分析[15]。最新的Oncomine版本包括715個(gè)數(shù)據(jù)集和86733個(gè)樣本,主要整合了TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和已發(fā)表的文章。本研究通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析BTK基因異常表達(dá)與結(jié)直腸癌、腎癌、白血病、肺癌、肉瘤有關(guān),其中共有3項(xiàng)NSCLC的研究符合參數(shù)閾值設(shè)置[7-8]。Oncomine綜合分析可知BTK在NSCLC中處于低表達(dá)水平。GEPIA基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中的9736個(gè)腫瘤和8587個(gè)正常樣本的基因表達(dá)分析,可進(jìn)行差異表達(dá)分析、生存分析等[16]。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步亞組分析BTK在LUAD和LUSC中都處于低表達(dá)水平。通過(guò)檢索Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù),BTK在NSCLC及其亞組中處于低表達(dá)狀態(tài)。CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)包含了947個(gè)人類(lèi)癌細(xì)胞系的基因表達(dá)[17]。通過(guò)CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)分析可知,BTK在NSCLC細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平處于低表達(dá)狀態(tài)。多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示BTK在NSCLC組織中和NSCLC細(xì)胞系中均處于低轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。Kaplan-Meier plotte可以很快速查找的基因與肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌5種腫瘤的關(guān)系[18]。在本研究中,K-M plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線(xiàn)分析BTK在NSCLC中,高表達(dá)的BTK的在NSCLC中有更高的生存率。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中主要是應(yīng)用特制抗體用免疫組織化學(xué)檢測(cè)正常組織和腫瘤組織中蛋白的表達(dá)[19],可見(jiàn)BTK在NSCLC中處于低表達(dá)。Bi等[20]也基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析NSCLC中腫瘤微環(huán)境可能由免疫狀態(tài)轉(zhuǎn)向代謝狀態(tài)時(shí)BTK降低,低表達(dá)的BTK在LUAD中有更好的預(yù)后。

總之,利用高通量數(shù)據(jù)庫(kù)可以快速檢索特定基因在特定腫瘤中的表達(dá)水平。借助整合后的高通量數(shù)據(jù)庫(kù)可以篩查腫瘤潛在的治療靶點(diǎn),為進(jìn)一步的研究提供了理論依據(jù)和方向,也避免了研究的盲目性,縮短了研究周期。本研究采用高通量數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)的闡述了BTK在NSCLC表達(dá)水平和臨床意義,然而目前尚無(wú)BTK轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平定量的研究報(bào)道,今后將繼續(xù)開(kāi)展此方面的深入研究,以進(jìn)一步探討和驗(yàn)證BTK在NSCLC中潛在的作用機(jī)制和臨床意義。