趙鳳霞，米琳，丁燕芳，宋學(xué)立，何嘉，孫小瑞，徐沛瑤，王海濤

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南 許昌 461000）

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，也是一種重要的模式植物，在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面發(fā)揮了巨大作用。煙草病害一直是嚴(yán)重制約世界煙草生產(chǎn)和科研發(fā)展的重要難題，其中煙草鐮刀菌根腐病是近年來危害煙草行業(yè)的最重要病害之一［1，2］，在河南、山東、云南、貴州等地均有發(fā)生，發(fā)病范圍和程度有逐年加重的趨勢，部分省市重病煙田發(fā)病率達(dá)30%以上［2，3］。2013年河南省平頂山煙區(qū)發(fā)病率高達(dá)5%～10%，造成3 000萬元左右的經(jīng)濟損失。本課題組對烤煙根腐病的分離和鑒定以及河南省主栽烤煙品種抗病性進(jìn)行了大量研究，認(rèn)為引起河南省煙草鐮刀菌根腐病的優(yōu)勢致病菌為尖孢鐮刀菌，約占總致病菌的81.25%［4，5］。

目前根腐病的防治主要采用抗病育種和生物防治的方法，但具體操作具有一定局限性，由于缺乏特效藥劑和抗性品種，煙草根腐病的治理難度相當(dāng)大，危害極其嚴(yán)重［6］。只有充分認(rèn)識病原菌的致病機制，才能找到最經(jīng)濟、有效、環(huán)保的防治方法，降低根腐病的危害程度。目前對煙草抗病機理的研究主要集中在抗病基因定位和分子標(biāo)記輔助育種［7］、基因組學(xué)和抗性基因的轉(zhuǎn)化等方面［8］，而通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法結(jié)合抗病相關(guān)生理生化指標(biāo)的檢測，對烤煙抗病性開展的研究較少。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)為抗病性研究提供了同步進(jìn)行多處理、多組織比較的平臺，研究植物在病原菌侵染條件下多重應(yīng)對通路的串?dāng)_，有利于全面了解植物針對病原菌侵染的應(yīng)對網(wǎng)絡(luò)［9］。目前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。王元英［10］對普通煙草種紅花大金元及野生種林煙草、絨毛狀煙草、耳狀煙草開花時期的主要器官（根、莖、葉和花）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序與分析，對比絨毛狀煙草全基因組，并根據(jù)絨毛狀煙草基因組抗病相關(guān)R基因的生物信息分析結(jié)果，選取其中的重要基因批量設(shè)計引物，構(gòu)建了高通量的煙草RNAi載體庫，為進(jìn)一步開展煙草抗病相關(guān)R基因的克隆及其功能的鑒定驗證奠定了基礎(chǔ)。Ferrario-Méry等［11］研究了煙草中碳氮的代謝途徑，整合了該代謝途徑中轉(zhuǎn)錄組、酶活性及代謝組學(xué)的相互關(guān)系，分析了谷氨酰胺合成酶在氮代謝過程中的作用。

研究鐮刀菌根腐病侵染后烤煙根系基因表達(dá)以及抗病相關(guān)酶類活性和物質(zhì)含量的差異，結(jié)合內(nèi)源激素含量差異分析，有助于深入研究烤煙抗病機理，為烤煙根腐病的預(yù)測預(yù)警提供數(shù)據(jù)支撐和根腐病的有效防治和培育高抗品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為河南省主栽品種‘中煙100’。選取大田生長條件下感病煙株（記作T），經(jīng)鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）致病株，以同地塊未侵染的正常生長煙株作為對照（記作CK）。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法 提取樣本RNA，檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA進(jìn)行隨機打斷，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymeraseⅠ合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后通過PCR富集得到cDNA文庫。庫檢合格后，用HiSeq 2500進(jìn)行高通量測序，測序讀長為PE100。對Raw Data進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量Reads獲得高質(zhì)量的Clean Data，將Clean Data進(jìn)行序列組裝，獲得該物種的Unigene庫。采用Trinity軟件進(jìn)行組裝，使用BLAST［12］軟件將Unigene 序 列 與 NR［13］、Swiss-Prot［14］、GO［15］、COG［16］、KOG［17］、KEGG［18］數(shù)據(jù)庫比對，預(yù)測完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER［19］軟件與Pfam［20］數(shù)據(jù)庫比對，獲得Unigene的注釋信息。

1.2.2 根系外觀形態(tài)檢測 使用EPSON LA2400掃描儀觀察根系形態(tài)差異，利用WinRHTZO根系分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.2.3 酶類活性等生理指標(biāo)測定 參考前人的檢測方法［21］：超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法；過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用比色法；抗壞血酸過氧化物酶（APX）、多酚氧化酶（PPO）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性、總抗氧化能力（T-AOC）和超氧陰離子清除率采用酶標(biāo)儀法；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定采用紫外分光光度法；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚比色法；氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量采用2-VP法測定；脯氨酸（PRO）含量采用可見分光光度法測定；丙二醛（MDA）含量的測定采用2-硫代巴比妥酸顯色法。

1.2.4 內(nèi)源激素含量測定 采用HPLC法進(jìn)行測定：稱取0.1 g樣本，放入研缽中磨碎，加入1mL預(yù)冷的試劑一，4℃浸提過夜。8 000×g離心10 min，殘渣用0.5 mL試劑一浸提2 h，離心后取上清液，合并兩次上清液，40℃減壓蒸發(fā)至不含有機相（約剩0.5 mL水溶液），加入0.5 mL試劑二萃取脫色3次，棄去上層醚相，下層40℃減壓蒸干，加入0.5 mL試劑三溶解，針頭式過濾器過濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶內(nèi)待測。

HPLC液相條件：Rigol L3000高效液相色譜儀，Kromasil C18反相色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）。流動相的配制：取200 mL甲醇和300 mL超純水混合，加入3 mL試劑四，混勻。進(jìn)樣量10μL，流速0.8 mL／min，柱溫35℃，走樣時間40 min，檢測波長254 nm。用流動相過柱子，待基線穩(wěn)定后加樣。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2007、SPSS 17對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

通過RNA-seq技術(shù)，對病原菌侵染的‘中煙100’和對照根系的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序，共獲得30.71 Gb Clean Data，通過Trinity組裝，共得到907 812條Transcript和686 933條Unigene（表1）。

表1 組裝結(jié)果統(tǒng)計表

將獲得的Unigene序列與COG、KEGG等數(shù)據(jù)庫比對，預(yù)測完Unigene的氨基酸序列之后與Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得Unigene的注釋信息。通過選擇BLAST參數(shù)E-value不大于10-5和HMMER參數(shù)E-value不大于10-10，最終獲得373 204個有注釋信息的Unigene，基因注釋的統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。

表2 Unigene注釋統(tǒng)計

采用DESeq進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，獲得差異表達(dá)基因集。通過NR庫對Unigene進(jìn)行基因注釋，對所有的Unigene進(jìn)行物種分類，將屬于煙草的Unigene序列單獨列出，進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，差異表達(dá)基因數(shù)如表3所示。

表3 煙草中差異表達(dá)基因數(shù)

對差異表達(dá)基因進(jìn)行模式聚類、功能注釋以及富集性分析，結(jié)果顯示差異基因的功能主要涉及不同生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能等幾個方面。將Unigene與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示一般功能性基因的Unigene最多，其次為轉(zhuǎn)錄翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能相關(guān)的Unigene，差異基因主要涉及核糖體的結(jié)構(gòu)成分、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性因子、序列特異性DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、過氧化還原酶活性、纖維素合酶（形成UDP）活性、rRNA結(jié)合等方面。對差異表達(dá)基因KEGG的注釋結(jié)果按照KEGG中通路類型進(jìn)行分類，其中新陳代謝相關(guān)的Unigene占比最高；遺傳信息傳遞相關(guān)的差異表達(dá)基因中以蛋白質(zhì)加工相關(guān)基因含量最高；代謝過程的差異表達(dá)基因以淀粉和蔗糖代謝相關(guān)的基因含量最高；信號傳導(dǎo)過程相關(guān)的差異表達(dá)基因以植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因含量最高；另外，植物病原體互作相關(guān)基因所占比例也較高。

2.2 侵染煙株形態(tài)

病原菌侵染前后，整個煙株及根系外觀形態(tài)差異顯著。與正常煙株相比，發(fā)病煙株矮小，葉片發(fā)黃枯萎；主根和側(cè)根數(shù)量顯著減少，呈腐漬狀且變黑腐爛（圖1）。

圖1 病原菌侵染后煙株及根系形態(tài)

由表4可知，病原菌侵染后煙株根系長度、截面積、表面積、根系體積均顯著低于對照株；侵染煙株平均直徑為0.78 mm，顯著高于對照株的0.47 mm。

表4 發(fā)病煙株根系形態(tài)指標(biāo)

2.3 內(nèi)源激素含量測定

與大田正常生長煙株相比，病原菌侵染后煙株根系和葉片吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、細(xì)胞分裂素（ZA）和脫落酸（ABA）含量均顯著升高（圖2）。病原菌侵染后烤煙根系IAA含量為對照的3.25倍，葉片IAA含量為對照的1.58倍；烤煙根系GA3含量為對照的5.68倍，葉片GA3含量為對照的1.65倍；烤煙根系ZA含量為對照的1.58倍，葉片ZA含量為對照的1.37倍；烤煙根系A(chǔ)BA含量為對照的1.57倍，葉片ABA含量為對照的2.45倍。

2.4 酶類活性及保護(hù)性物質(zhì)含量變化

2.4.1 抗氧化相關(guān)酶類活性變化 如圖3所示，病原菌侵染后烤煙根系SOD活性為14.73 U／mg prot，顯著高于對照（11.81 U／mg prot）；CAT活性為8.46 U／mg prot，極顯著高于對照（1.16 U／mg prot）；APX活性為0.015μmol／（min·mg prot），顯著低于對照［0.032μmol／（min·mg prot）］。

2.4.2 酚類化合物次生代謝相關(guān)酶類活性變化病原菌侵染后烤煙根系PAL、POD和PPO活性變化如圖4所示。侵染后根系PAL活性為3.91 U／mg prot，POD活性為4.28 U／mg prot，PPO活性為2.42 U／mg prot，均顯著高于對照。

圖2 病原菌侵染后烤煙根系和葉片內(nèi)源激素含量

圖3 病原菌侵染后烤煙根系抗氧化酶類活性

圖4 酚類化合物次生代謝相關(guān)酶類活性

2.4.3 谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)相關(guān)酶類活性和物質(zhì)含量 與谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)相關(guān)的酶類包括GSH-Px和GST。病原菌侵染后烤煙根系GSH-Px活性為313.91 nmol／（min·mg prot），極顯著高于對照［90.48 nmol／（min·mg prot）］；GST活性為1.46 nmol／（min·mg prot），顯著高于對照［0.43 nmol／（min·mg prot）］；氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量為0.25 nmol／mg prot，極顯著高于對照（0.03 nmol／mg prot）（圖5）。

圖5 谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)相關(guān)酶類活性和物質(zhì)含量

2.4.4 其它指標(biāo)含量變化 本研究檢測了鐮刀菌根腐病侵染后烤煙根系T-AOC、超氧陰離子清除能力、MDA以及PRO含量變化。結(jié)果（圖6）顯示，病原菌侵染后根系總抗氧化能力約為對照的12倍，超氧陰離子清除率、MDA和PRO含量均顯著升高。

圖6 烤煙根系T-AOC、MDA、PRO含量及超氧陰離子清除率等指標(biāo)變化

3 討論

病原菌侵染導(dǎo)致烤煙根系抗病相關(guān)基因表達(dá)量升高，根系和葉片內(nèi)源激素含量發(fā)生顯著變化，與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中對差異表達(dá)基因的KEGG注釋結(jié)果一致，即信號傳導(dǎo)過程相關(guān)的差異表達(dá)基因以植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因含量最高，另外，代謝相關(guān)基因和植物病原體互作相關(guān)基因所占比例也較高。

正常生長的植物體內(nèi)，抗氧化酶類和非酶類活性氧清除系統(tǒng)可以清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，自由基的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)是平衡的，植物不會受到傷害。在病原-寄主互作過程中，活性氧作為植物細(xì)胞的信號傳導(dǎo)分子，在病原菌入侵后迸發(fā)［22］，誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)活性增強，從而引起植物對脅迫的響應(yīng)。鐮刀菌根腐病侵染煙株后，根系活性氧自由基大量產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)了SOD、CAT等抗氧化酶類活性增強，與前人研究結(jié)果一致［23，24］。抗氧化酶類活性的增強是煙株對病原菌入侵的早期防衛(wèi)反應(yīng)，對于提高煙株自身抗病性具有重要意義。APX是植物體內(nèi)清除H2O2的一種重要抗氧化酶類，煙株被鐮刀菌根腐病病原菌侵染后根系A(chǔ)PX活性與對照相比顯著降低，與前述SOD和CAT等抗氧化酶類活性的變化趨勢并不相同，可能原因在于H2O2誘導(dǎo)了煙株根系的程序性細(xì)胞壞死反應(yīng)，防止病原菌進(jìn)一步侵染，而APX活性降低，可以防止H2O2的降解，該變化趨勢與Mittler等［25］對于煙株感染煙草花葉病毒的研究結(jié)果一致。

植物與病原菌互作過程中會發(fā)生代謝變化，而酚類化合物次生代謝是最為顯著的變化之一，PAL、POD和PPO與酚類化合物的合成和氧化密切相關(guān)，對植物抗病性發(fā)揮重要作用。PAL是植物體苯丙烷類物質(zhì)代謝的限速酶，是進(jìn)行抗、感品種比較和證明抗病因子作用的重要指標(biāo)之一。前人研究表明病原菌的侵染和病原菌毒素處理都能誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶活性增強，且酶活增強與抗病性正相關(guān)［26］。本研究煙株根系被病原菌侵染后PAL活性顯著高于對照，與前人在甘蔗等研究中的結(jié)果一致［27］。PAL活性升高可以促進(jìn)苯丙烷類物質(zhì)代謝，產(chǎn)生更多的代謝物，阻擋病原菌的入侵，從而降低病原菌造成的危害。POD可以催化H2O2或者氫過氧化物類似物反應(yīng)，清除活性氧自由基，同時它還參與植物酚類的聚合和氧化，以及木質(zhì)素和植保素的合成代謝，在植物抗病性中發(fā)揮重要作用。本研究中病原菌侵染后烤煙根系POD活性顯著高于對照。PPO催化木質(zhì)素和其他酚類氧化物的形成從而抵抗病原菌入侵，也與植物抗病性密切相關(guān)［28，29］，本研究中烤煙感病后根系PPO活性明顯升高，約為對照的2倍。

GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一，能夠特異地催化GSH與活性氧反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），從而保護(hù)生物膜免受活性氧的損害，維持細(xì)胞的正常功能；GST具有GSH-Px活性，可以修復(fù)氧化破壞的DNA、蛋白質(zhì)等大分子。本研究結(jié)果顯示，病原菌侵染后GSH-Px和GST活性均顯著升高。

在植物代謝過程中會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，它可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，超氧陰離子清除能力與機體衰老和病變有很密切的關(guān)系。本研究病原菌侵染后超氧陰離子清除能力顯著上升，約為對照根系的2倍。T-AOC是各種大小分子抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平，體現(xiàn)了該體系的抗氧化能力總和，病原菌侵染后T-AOC含量極顯著升高，約為對照的12倍。

PRO也與植物抗逆性密切相關(guān)，前人對于干旱和低溫等非生物脅迫的研究表明，逆境條件下煙草游離PRO含量有所增加，可以增強其抗逆性［30，31］。本研究結(jié)果顯示，病原菌侵染后烤煙根系游離PRO含量為對照根系的3倍，極顯著高于對照?；钚匝醯拇罅慨a(chǎn)生如果超出了植物清除活性氧的能力，會造成氧化脅迫，進(jìn)而造成蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其他細(xì)胞組分受到損傷，造成氧化損傷。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，通過與細(xì)胞中多種成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，引起寄主防御反應(yīng)的發(fā)生［32］，其含量的多少直接體現(xiàn)了活性氧對膜脂的毒害和損傷程度［33，34］。本研究病原菌侵染后的烤煙根系MDA含量顯著高于對照，表明病原菌對根系的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成了嚴(yán)重破壞，活性氧造成的損害較為嚴(yán)重，與梁鄲娜等［32］在黃瓜、黃偉等［35］在苜蓿上的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

烤煙根系被病原菌侵染后，基因表達(dá)發(fā)生變化，抗病相關(guān)基因、代謝以及內(nèi)源激素合成相關(guān)基因表達(dá)量上升。同時根系發(fā)生了顯著的生理生化變化，為了能夠保持正常生長發(fā)育，激發(fā)了體內(nèi)的一系列防御性酶類發(fā)揮作用，如SOD、POD、CAT、PPO、PAL等，同時PRO和MDA含量增加，抗氧化物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)等物質(zhì)含量的上升都在烤煙抵御病原菌侵染的過程中發(fā)揮著重要的保護(hù)和修復(fù)作用，這些酶類和物質(zhì)的活性變化有效抑制了活性氧自由基的產(chǎn)生，并提高了植物對病原菌脅迫的抵抗能力。