郝立君，許 騰，李智偉，楊舒婷，劉紅春

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨檢中心，新疆烏魯木齊 830001

免疫性血小板減少癥(ITP)是臨床上較為常見的出血性疾病，屬于自身免疫性疾病，主要是由于自身抗血小板抗體導(dǎo)致血小板破壞增加和血小板生成受到抑制，臨床主要表現(xiàn)為皮膚淤點(diǎn)、淤斑，嚴(yán)重者可出現(xiàn)內(nèi)臟或顱內(nèi)出血[1]。研究表明，ITP的發(fā)生與體液免疫及細(xì)胞免疫失調(diào)有關(guān)[2]，包括自身抗體、B細(xì)胞因子、輔助性T細(xì)胞(Th)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)[3]。B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生血小板抗體，導(dǎo)致血小板破壞增多，同時(shí)免疫系統(tǒng)失衡使得相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)出現(xiàn)變化，進(jìn)一步影響血小板的生成與釋放[4]。目前，關(guān)于ITP的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明了，本文通過流式細(xì)胞術(shù)研究ITP患者治療前后調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg細(xì)胞)占CD19+細(xì)胞的百分比、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比的變化及與白細(xì)胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的相關(guān)性，進(jìn)一步探討以上指標(biāo)在ITP發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2019年12月本院血液病科收治的初診患有ITP的住院患者35例為研究對象。35例ITP患者中男性24例，女性11例；年齡25～77歲，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25，P75)]為42(38,62)歲。ITP的臨床診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[1]的評分要求，治療前PLT<30×109/L(ITP治療前組)，治療后PLT>50×109/L(ITP治療后組)。選取同期體檢健康者40例作為健康對照組，男性26例，女性14例；年齡24～71歲，年齡38(30,48)歲。ITP患者與體檢健康者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床初診ITP患者；患者自愿參與本試驗(yàn)并由本人或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個(gè)月內(nèi)接受過激素、丙種球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、免疫抑制劑、化療藥物、血小板生成素受體激動劑等治療；(2)合并血小板降低等其他疾病，如感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等免疫類疾病，血液或其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(3)入院時(shí)已輸注血小板進(jìn)行血象糾正。

1.2儀器與試劑 淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購自美國GE公司；CD38 FITC(333173，HB7)、CD24 APC(656150， ML5)、CD45 PerCP(340385，X40)、CD19 PE(349209，4G7)；CD4 FITC(340039，SK3)、CD127 PE(552543，SB/119)、CD3 PerCP(340298，SK3)、CD25 APC(340938，2A3)流式抗體購自美國BD公司；細(xì)胞因子IL-10和TNF-α檢測使用北京曠博公司AimPlex 流式高通量多因子檢測試劑盒及美國BD公司FACS Canto Plus流式細(xì)胞儀。

1.3方法

1.3.1血樣采集 分別采集體檢健康者和ITP患者治療前后外周靜脈血(空腹)兩管，其中一管采用乙二胺四乙酸(EDTA)進(jìn)行抗凝，采集6 mL用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；另一管使用無添加劑采血管采集3 mL離心后取血清轉(zhuǎn)入EP管，放置于-80 ℃凍存用于IL-10、TNF-α水平檢測。

1.3.2分離PBMC 將6 mL外周血與磷酸緩沖鹽溶液(PBS)按1∶1的比例稀釋混勻。取6 mL Ficoll于50 mL離心管中，傾斜45°，將稀釋后的血液在Ficoll上方1 cm處沿管壁緩慢加至Ficoll上面。18～20 ℃、2 000 r/min離心30 min后輕輕吸出單個(gè)細(xì)胞層放入新的離心管中。加入3倍于PBMC體積的PBS，2 000 r/min 離心30 min，重復(fù)2次。棄上清液制備成PBMC細(xì)胞懸液。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測Breg細(xì)胞和Treg細(xì)胞 Breg細(xì)胞檢測管吸取100 μL全血，然后加入CD38 FITC 20 μL、CD19 PE 20 μL、CD45 PerCP 20 μL、CD24 APC 5 μL。Treg細(xì)胞檢測管吸取100 μL全血，然后加入CD4 FITC 20 μL、CD127 PE 20 μL、CD3 PerCP 20 μL，CD25 APC 5 μL。將檢測管避光放置15 min后加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，溶血10 min后離心去上清液，再加入2 mL PBS洗滌離心去上清液，加入500 μL PBS，重懸。使用美國BD公司FACS Canto Plus流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，檢測數(shù)據(jù)使用FlowJo 10.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比和Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比。

1.3.4流式Aimplex法檢測細(xì)胞因子IL-10和TNF-α水平 (1)標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉(使用前約4 300 r/min離心10 s)，加入250 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，混勻冰浴5 min，取8聯(lián)管(標(biāo)記1～8)，每管加入120 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，取60 μL標(biāo)準(zhǔn)品原液加入8號管并混勻，由8號管依次轉(zhuǎn)移60 μL到上一管混勻，直至2號管，1號管加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為本底，完成梯度稀釋。(2)從冰箱中取出樣品復(fù)融。(3)加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，每孔45 μL，封板并避光室溫震蕩60 min。(4)用抽濾器抽掉孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL洗液洗3次。(5)加入Biotin-dAb(二抗)，每孔25 μL，封板并避光室溫震蕩30 min。(6)用抽濾器抽掉孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL洗液洗3次。(7)加入藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素，每孔25 μL，封板并避光室溫震蕩20 min。(8)用抽濾器抽掉孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL洗液洗3次。(9)加入讀數(shù)液，每孔150 μL，備用。(10)取剩余微球加入400 μL 讀數(shù)液混勻倒入流式管，上機(jī)調(diào)門框。(11)吹吸各孔內(nèi)液體使孔內(nèi)微球懸浮，轉(zhuǎn)入流式管上機(jī)進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比和Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比比較 與健康對照組比較，ITP治療前組Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比顯著降低，Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比也顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.855、5.730，均P<0.01)。與健康對照組比較，ITP治療后組Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比顯著降低，Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比也顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.186、2.037，均P<0.05)。與ITP治療前組比較，ITP治療后組的Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比顯著升高，Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比也顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.859、5.730，均P<0.01)。見表1和圖1～2。

2.2ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組外周血IL-10、TNF-α水平比較 與健康對照組比較，ITP治療前組外周血IL-10水平顯著降低，而TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.551、23.90均，P<0.01)。與健康對照組比較，ITP治療后組外周血IL-10水平顯著降低，而TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.428、15.62，均P<0.01)。與ITP治療前組比較，ITP治療后組外周血IL-10水平顯著升高，而TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.463、12.18，均P<0.01)。見表2。

表1 ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組Breg占CD19+細(xì)胞的百分比和Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比比較

表2 ITP治療前組、ITP治療后組及健康對照組外周血IL-10、TNF-α水平比較

注：A表示ITP治療前組；B表示ITP治療后組；C表示健康對照組。

2.3外周血Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比、Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比、IL-10、TNF-α水平的相關(guān)性分析 外周血Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比與外周血IL-10水平呈正相關(guān)(r=0.763 2，P<0.01)，與TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.647 1，P<0.01)，與外周血Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)(r=0.691 7，P<0.01)。見圖3。

注：A表示ITP治療前組；B表示ITP治療后組；C表示健康對照組。

注：A表示Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比與IL-10水平的相關(guān)性；B表示Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比與TNF-α水平的相關(guān)性；C表示Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比與Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比的相關(guān)性。

3 討 論

一般認(rèn)為ITP發(fā)病機(jī)制為患者體內(nèi)產(chǎn)生自身抗血小板抗體，使血小板破壞增多或生成受到抑制。機(jī)體免疫狀態(tài)失衡是導(dǎo)致ITP進(jìn)展的關(guān)鍵因素，眾多免疫細(xì)胞參與其中[5-6]。目前對于ITP的免疫相關(guān)研究主要集中于Breg與Treg這兩種調(diào)節(jié)性細(xì)胞[7]。Breg細(xì)胞在免疫相關(guān)性疾病中對B細(xì)胞具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，B細(xì)胞在多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，ITP患者血液中B細(xì)胞增殖、分化產(chǎn)生抗體導(dǎo)致血小板破壞增加[8-9]。Breg細(xì)胞存在于脾臟中，在B細(xì)胞中占比不足1%，具有免疫調(diào)節(jié)特性[5]，并通過分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[6]，如果Breg細(xì)胞功能減弱或缺失可能引起多種自身免疫性疾病[10]。本研究結(jié)果提示，ITP治療前組外周血Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比較健康對照組降低，ITP治療后組外周血Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞百分比較ITP治療前組升高，ITP治療后組外周血IL-10水平雖低于健康對照組但顯著高于ITP治療前組，且與Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)，提示在ITP疾病中Breg細(xì)胞通過分泌IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制免疫反應(yīng)，延緩甚至改善ITP疾病進(jìn)展。這與朱世榮等[11]報(bào)道的Breg細(xì)胞作用于相應(yīng)的靶向T細(xì)胞，通過分泌IL-10發(fā)揮免疫抑制作用抑制自身免疫發(fā)生的結(jié)論一致。

Breg細(xì)胞可促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞[12]，本研究中外周血Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比與Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)，Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比與IL-10水平亦呈正相關(guān)。Breg細(xì)胞是IL-10的主要來源，同時(shí)可以抑制T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)Treg細(xì)胞[13-14]，因此，考慮Breg細(xì)胞所分泌的IL-10對Treg細(xì)胞的生成和維持起重要作用。Treg細(xì)胞是一群具有免疫抑制特性的細(xì)胞，受Breg細(xì)胞調(diào)控的同時(shí)自身又可分泌IL-10及TGF-β，發(fā)揮免疫抑制功能[15]。有研究表明，可能Treg細(xì)胞生成減少導(dǎo)致CD4+細(xì)胞活化增強(qiáng)，使得IL-2與γ干擾素等細(xì)胞因子升高，從而使T淋巴細(xì)胞釋放穿孔素殺傷血小板自身抗原，并且能增強(qiáng)單核細(xì)胞的吞噬作用，致使血小板破壞增加[11]。本研究數(shù)據(jù)顯示，ITP治療后組外周血Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的百分比略低于健康對照組，但顯著高于ITP治療前組，因此，恢復(fù)Treg細(xì)胞功能在治療ITP患者的過程中尤為重要。

TNF-α作為Th1細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子類型，在感染性休克、腎移植排斥反應(yīng)、彌散性血管內(nèi)凝血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中起重要作用，在惡性腫瘤發(fā)生時(shí)能夠一定程度上抑制或殺死腫瘤細(xì)胞，但長期表達(dá)又可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡化[16-17]。IL-10可抑制CD4+T細(xì)胞的活化及Th0細(xì)胞向Th1和Th2細(xì)胞的分化，從而使得TNF-α及IL-4等細(xì)胞因子減少，并且誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞的凋亡及調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，從而抑制自身免疫的發(fā)生[11]。本研究中，外周血Breg細(xì)胞占CD19+細(xì)胞的百分比與TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)，ITP治療后組TNF-α水平雖較健康對照組顯著升高(P<0.05)，但相對于ITP治療前組顯著降低，提示ITP患者體內(nèi)的T細(xì)胞免疫功能紊亂，甚至受到破壞，而該項(xiàng)目能否作為預(yù)后判斷指標(biāo)尚待進(jìn)一步研究。ITP患者體內(nèi)同時(shí)存在Th1/Th2免疫失衡，但對于是哪一種免疫反應(yīng)處于主導(dǎo)地位仍存在爭議[18-19]，如果能夠明確其轉(zhuǎn)化機(jī)制并進(jìn)行干預(yù)將有助于疾病的治療。目前對于ITP的主要治療藥物是糖皮質(zhì)激素、靜脈注射人免疫球蛋白、利妥昔單抗[19]，通過本研究可以推測，細(xì)胞因子治療方法能夠?yàn)镮TP治療提供新的思路。

綜上所述，外周血Breg細(xì)胞與Treg細(xì)胞在ITP的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，能通過分泌IL-10等細(xì)胞因子抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞活性，Breg細(xì)胞又可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞共同參與ITP患者體內(nèi)免疫抑制，降低機(jī)體自身免疫功能。TNF-α又被IL-10的水平所影響，從而影響疾病進(jìn)程，有助于臨床診療。ITP屬于免疫缺陷性疾病，研究其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，對于疾病靶向藥物的研制及臨床治療至關(guān)重要，同時(shí)也為其他自身免疫性疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。