胡瑩瑩　趙麗　史力學(xué)　李全合

摘要：利用VITEK 2compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)漿水發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌種類及數(shù)量進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)乳酸菌有4株乳酸菌菌株和2株酵母菌菌株。4株乳酸菌菌株分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），其中優(yōu)勢(shì)菌群為發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌;2株酵母菌菌株分別為平常假絲酵母（Candida inconspicua）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）。漿水發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌為發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌。漿水發(fā)酵至第3～4 天時(shí)，植物乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，發(fā)酵乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，短乳桿菌為3.2×106～6.5×107 CFU/mL，乳酸片球菌為4.6×105～2.5×106 CFU/mL，此時(shí)漿水風(fēng)味最佳。

關(guān)鍵詞：漿水;發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌群;乳酸菌;酵母菌;分離鑒定

中圖分類號(hào)：TS255.3 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2021）04-0043-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.04.011

Isolation and Identification of Dominant Lactic Acid Bacteria in Fermented Pickle Juice

HU Yingying， ZHAO Li， SHI Lixue， LI Quanhe

（Tianshui Food Inspection and Testing Center， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract：VITEK 2Compact automatic microbial identification system was used to identify the species and quantity of lactic acid bacteria in the pickle juice fermentation process. The results showed that there were 4 strains of lactic acid bacteria and 2 strains of yeast in the fermentation process. The four Lactobacillus strains were Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici， respectively， and the dominant bacteria were Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis. Two strains of yeast strains respectively Candida inconspicua and Candida rugosa. The dominant lactic acid bacteria in the fermentation of pickle juice were Lactobacillus fermentum and Lactobacillus brevis. At the 3rd to 4th day of fermentation， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum， Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici were 1.2×107～1.6 ×107 CFU/mL， 1.2×107～1.6 ×107 CFU/mL， 3.2×106～6.5×107 CFU/mL and 4.6×105～2.5×106 CFU/mL， respectively， indicating the best flavor of the pickle juice.

Key words：Pickle juice;Dominant population;Lactic acid bacteria;Yeast;Isolation and identification

發(fā)酵蔬菜是以各種蔬菜為原料，利用有益微生物的活動(dòng)并且控制其一定的生長(zhǎng)條件，對(duì)蔬菜進(jìn)行發(fā)酵加工后制成的食品。發(fā)酵蔬菜主要有泡菜、酸菜、醬菜和腌菜等[1 - 2 ]。漿水是甘肅、陜西等我國(guó)西北地區(qū)民間廣泛流傳的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，一般以芹菜為原料，加入面湯和老漿水（俗稱“引子”）發(fā)酵而成?？谖端岽?、清香，且其漿水營(yíng)養(yǎng)豐富，具有調(diào)中引氣、開胃止渴、解煩去睡、調(diào)理臟腑、利小便和降血壓等功效[3 ]。傳統(tǒng)漿水發(fā)酵微生物菌系復(fù)雜，主要包括枯草芽孢桿菌、醋酸菌 、乳酸菌、酵母菌、霉菌等，其中優(yōu)勢(shì)菌群為乳酸菌和酵母菌，且乳酸菌多為厭氧或兼性厭氧菌株[3 - 6 ]。我們按照已有傳統(tǒng)工藝制作芹菜漿水，研究了漿水發(fā)酵中乳酸菌種類及其優(yōu)勢(shì)菌群、變化規(guī)律，以期對(duì)漿水工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 供試材料

供試新鮮漿水、芹菜、面粉均為市售。

1.2 ? 儀器與設(shè)備

EX30生物顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司），Bio II Advance二級(jí)生物安全柜（西班牙泰事達(dá)公司），XW-80A旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)股份有限公司），MJ-350B霉菌培養(yǎng)箱、SPX-350B生化培養(yǎng)箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社），MGC厭氧培養(yǎng)盒（日本三菱化學(xué)株式會(huì)社中國(guó)有限公司），VITEK 2compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃股份有限公司）。

1.3 ? 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基，鑒定培養(yǎng)基為蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基、V-P實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基、含5%羊血的胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基、含5%羊血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 ? 試驗(yàn)方法

1.4.1 ? ?漿水制作工藝 ? ?采用傳統(tǒng)工藝。將芹菜洗凈切成寸段，沸水熱燙3 min撈出，瀝水備用。用面粉、水按質(zhì)量比1∶200煮制面湯，芹菜、面湯按質(zhì)量比1∶4入缸，溫度降至30 ℃時(shí)按4%含量加入上述原漿水為引子，攪勻后進(jìn)行發(fā)酵[7 ]。

1.4.2 ? ?芹菜漿水發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群的變化

漿水中優(yōu)勢(shì)菌有乳酸菌、酵母菌。采用平板計(jì)數(shù)法，在發(fā)酵當(dāng)天起每天同時(shí)采樣，乳酸菌按GB4789.35 — 2016方法[8 ]、酵母菌按GB4789.15 — 2016方法測(cè)定其菌數(shù)[9 ]，記錄培養(yǎng)皿中各類菌落數(shù)目、優(yōu)勢(shì)菌等。具體培養(yǎng)條件詳見表1。

1.4.3 ? ?發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌群的分離鑒定 ? ?①分離純化。在 MRS 培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基上，用接種環(huán)挑取生長(zhǎng)形態(tài)不同，具有鈣圈的優(yōu)勢(shì)菌落于無(wú)菌生理鹽水中，濃度稀釋到×10-5、×10-7。涂布接種于分離培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng) 72 h 后挑取菌落豐厚，且占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單菌落反復(fù)純化，從不同發(fā)酵時(shí)期的漿水中分離出不同形態(tài)菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)。將所獲菌株編號(hào)并保存?zhèn)溆谩＂诰瓿醪借b定。鏡檢菌落形態(tài)和菌體形態(tài)。③生理生化鑒定。將上述菌株連續(xù)活化2次，通過(guò)革蘭染色鏡檢，KOH試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、H2S 試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽、明膠液化、吲哚試驗(yàn)、產(chǎn)葡聚糖試驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵等試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定[6， 8 ]。④儀器生化鑒定。用接種環(huán)挑取適量培養(yǎng)18～24 h的菌苔至3 mL 0.45%NaCl溶液中， 配成0.5～0.65 Mac單位的菌懸液，選用適合的VITEK鑒定卡，將卡上彎管插入配制好的菌懸液中， 置于VITEK 2compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行儀器自動(dòng)讀卡鑒定。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 菌株分離和純化

經(jīng)幾代純化獲得6株菌株，其中由MRS上分得3株，分別記為L(zhǎng)1、L2、L3;由MC上分得1株記為L(zhǎng)4，由孟加拉紅上分得2株，分別記為Y1、Y2。

2.2 ? 菌株初步鑒定

分別對(duì)L1、L2、L3、L4、Y1、Y2等菌株在 MRS培養(yǎng)基 、MC培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上的菌落和菌體形態(tài)特征進(jìn)行觀察的結(jié)果見表2、圖1。由表2和圖1看出，菌株Y1、Y2菌體為革蘭染色藍(lán)色，菌體較大，棒狀或橢圓狀，有芽殖等，初步判定為酵母菌，菌株L1、L2、L3、L4需進(jìn)一步鑒定。

2.3 ? 生理生化鑒定

生理生化鑒定的結(jié)果（表3、表4）表明，菌株L1、L2、L3、L4 的KOH、H2O2、V-P、吲哚試驗(yàn)均表現(xiàn)為陰性，但對(duì)碳水化合物的利用不同，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》 （第八版）、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法[10 - 11 ]，將菌株 L1、L2、L3、L4初步鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）;依據(jù)《酵母菌特性及鑒定手冊(cè)》和《真菌鑒定手冊(cè)》[12 - 13 ]，將分離菌株Y1、Y2初步鑒定為假絲酵母（Candida inconspicua、Candida inconspicua）。VITEK 2compact 微生物分析系統(tǒng)自動(dòng)化程度高，較傳統(tǒng)生化鑒定試劑盒操作簡(jiǎn)單，且耗時(shí)更短，快速高效，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。從表5可以看出，經(jīng)VITEK 2compact 鑒定，菌株L1為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株L2為 發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株L3為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），菌株L4為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），菌株Y1為平常假絲酵母（Candida inconspicua），菌株Y2為皺褶假絲酵母（Candida rugosa），可見 VITEK 2compact 鑒定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果基本吻合。

2.4 ? 漿水發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)乳酸菌群的變化

漿水發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)乳酸菌群生長(zhǎng)變化情況見表6及圖2，酵母菌生長(zhǎng)變化見圖3。由表6及圖2可見，漿水發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌群菌株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）以第4天數(shù)量最多，為1.6×107 CFU/mL;第3天次之，為1.2×107 CFU/mL，其余時(shí)間為8.5×105～9.0×106 CFU/mL。發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）以第2天最多，為5.0×108 CFU/mL;第3天次之，為1.3×108 CFU/mL;其余時(shí)間為5.4×106～1.4×107 CFU/mL。短乳桿菌（Lactobacillus brevis）以第3天最多，為6.5×107 CFU/mL;第2天次之，為4.6×107 CFU/mL;其余時(shí)間為2.5×105～1.9×107 CFU/mL。乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）以第4天最多，為2.5×106 CFU/mL;第3天次之，為4.6×105 CFU/mL;其余時(shí)間為1.5×102～4.6×105 CFU/mL。菌株Y1為平常假絲酵母（Candida inconspicua），菌株Y2為皺褶假絲酵母（Candida rugosa），二者均為假絲酵母，因此平常假絲酵母+皺褶假絲酵母以第6天、第7天最多，均為3.5×105 CFU/mL;第5天次之，為3.0×105 CFU/mL;其余時(shí)間為9.2×103～2.2×105 CFU/mL?？梢?，在漿水發(fā)酵初期（1～2 d）乳酸菌數(shù)量較少，產(chǎn)品沒(méi)有酸味，此時(shí)主要是需氧微生物枯草芽孢桿菌、醋酸菌、明串珠菌占優(yōu)勢(shì)[6 ]。2 d后乳酸菌數(shù)量開始增加，隨著酸度的降低成為優(yōu)勢(shì)菌群，活躍是在發(fā)酵中期（3～5 d），這與前人的研究基本一致[6 ]。此時(shí)發(fā)酵乳桿菌、希氏乳桿菌生長(zhǎng)占優(yōu)勢(shì)，在發(fā)酵第3天達(dá)到峰值;隨著發(fā)酵的進(jìn)行，屬于同型乳酸發(fā)酵的植物乳桿菌開始占優(yōu)勢(shì)并在第4天達(dá)到峰值。從計(jì)數(shù)上看，在乳酸菌活躍的整個(gè)發(fā)酵期，發(fā)酵乳桿菌和希氏乳桿菌在數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，乳酸片球菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量較少，不是優(yōu)勢(shì)菌群;發(fā)酵后期（第6～10天）乳酸菌數(shù)量減少，活力下降。由圖3可知，漿水發(fā)酵過(guò)程中酵母菌數(shù)量呈先增加后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵前中期酵母菌生長(zhǎng)受抑制，隨著乳酸菌活力的下降，從4 d后開始迅速生長(zhǎng);在發(fā)酵中后期（第5～7天）占優(yōu)勢(shì)，同時(shí)在第6～7天時(shí)酵母菌數(shù)量達(dá)到峰值。試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵6 d后漿水開始有霉菌滋生，霉菌、酵母菌的數(shù)量逐漸增加，質(zhì)量下降，風(fēng)味不再酸香爽口。可見漿水在發(fā)酵第3～4天時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)，食用風(fēng)味最佳。

3 ? 結(jié)論

經(jīng)鑒定及測(cè)定，發(fā)現(xiàn)漿水中乳酸菌群有植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌、乳酸片球菌等，其中優(yōu)勢(shì)菌群為發(fā)酵乳桿菌和短乳桿菌，酵母菌群有平常假絲酵母+皺褶假絲酵母。漿水發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)乳酸菌群菌株植物乳桿菌以第4天最多，為1.6×107 CFU/mL;第3天次之，為1.2×107 CFU/mL，其余時(shí)間為8.5×105～9.0×106 CFU/mL。發(fā)酵乳桿菌以第2天最多，為5.0×108 CFU/mL;第3天次之，為1.3×108 CFU/mL，其余時(shí)間為5.4×106～1.4×107 CFU/mL。短乳桿菌以第3天最多，為6.5×107 CFU/mL;第2天次之，為4.6×107 CFU/mL，其余時(shí)間為2.5×105～1.9×107 CFU/mL。乳酸片球菌以第4天最多，為2.5×106 CFU/mL;第3天次之，為4.6×105 CFU/mL，其余時(shí)間為1.5×102～4.6×105 CFU/mL。菌株Y1為平常假絲酵母，菌株Y2為皺褶假絲酵母，二者均為假絲酵母，因此平常假絲酵母+皺褶假絲酵母以第6天、第7天最多，均為3.5×105 CFU/mL;第5天次之，為3.0×105 CFU/mL，其余時(shí)間為9.2×103～2.2×105 CFU/mL。漿水發(fā)酵至第3～4天時(shí)，植物乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，發(fā)酵乳桿菌為1.2×107～1.6×107 CFU/mL，短乳桿菌為3.2×106～6.5×107 CFU/mL，乳酸片球菌為4.6×105～2.5×106 CFU/mL，食用風(fēng)味最佳，可直接食用或真空貯藏待售。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）

收稿日期：2021 - 01 - 25;修訂日期：2021 - 03 - 01

基金項(xiàng)目：天水市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2020-SHFZKJK-4676）。

作者簡(jiǎn)介：胡瑩瑩（1986 — ），女，甘肅天水人，工程師，碩士，主要從事食品微生物檢測(cè)工作。Email：289579020@qq.com。