王 璐 劉 勤 張紅宇 王 瑋

云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,云南 昆明 650031

注射用燈盞花素是燈盞花素加入適宜的賦形劑，經冷凍干燥制成的無菌制品，其功能主治為活血化瘀、通絡止痛，是《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄》中藥注射劑品種，臨床廣泛用于中風及其后遺癥，冠心病、心絞痛等缺血性心腦血管疾病。注射用燈盞花素的現行質量標準收載于《中國藥典》2015年版一部，其中將野黃芩苷的含量測定作為質量控制指標，但由于中藥所含活性成分非常復雜，而且藥效的發(fā)揮往往是多種活性成分共同作用的結果，因此中藥檢測任何一種活性成分均不能完全體現其整體療效，為了使中藥的質量標準能更好地保證每批藥品的臨床使用安全有效，有必要在現有含量測定的基礎上增加生物活性測定檢測項目[1-2]，根據注射用燈盞花素的功能主治，選取小鼠體內血栓實驗、小鼠常壓耐缺氧實驗、小鼠凝血時間實驗來篩選適宜的生物活性測定指標。

1 試藥與動物

1號樣品：規(guī)格10 mg，批號20151126-2；2號樣品：規(guī)格10 mg 批號20170302-2 ； 3號樣品：規(guī)格25 mg 批號20151125-2；4號樣品：規(guī)格25 mg 批號20160927-1；5號樣品：規(guī)格50 mg，批號20161104-1；6號樣品：規(guī)格50 mg，批號20161020-1；以上樣品野黃芩苷含量測定分別為標示量的98.75%、98.60%、100.35%、99.62%、99.71%、100.17%。注射用燈盞花素最大人用劑量0.83 mg·kg-1。

膠原蛋白I型，酷爾生物，批號：B264565,規(guī)格1g；鹽酸腎上腺素注射液，上海和豐制藥有限公司，批號 10151101，規(guī)格1 mL∶1 mg；注射用鹽酸川芎嗪，合肥平光制藥有限公司，批號201509073，規(guī)格80 mg；尼莫地平注射液，揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號16051541，規(guī)格20 mL∶4 mg；血塞通注射液，規(guī)格5 mL∶250 mg 批號ZKC1501，昆明制藥有限公司。

試驗動物：小鼠，由成都達碩實驗動物有限公司提供，ICR,SPF級別，雌雄兼有，體重18～22 g，動物生產許可證號：SCXK(川)2015-030。

2 實驗方法及結果

2.1 小鼠體內血栓實驗[3]取健康小鼠96只(雌雄兼有)，體重18～20g，隨機分為注射用燈盞花素組(6個批號共6組)，氯化鈉注射液組(陰性對照組)、鹽酸川芎嗪組(陽性對照組)共8組，每組12只。注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量(臨床人用劑量的30倍)給藥，陽性藥組給予60 mg·kg-1的鹽酸川芎嗪(臨床人用劑量的30倍)。各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，尾靜脈注射血栓誘導劑造成小鼠血栓模型，血栓混合誘導劑含膠原蛋白0.60 mg· mL-1和腎上腺素0.02 mg· mL-1，給藥體積0.1 mL/10g，觀察小鼠死亡個數以及偏癱未恢復數(15 min內)，偏癱率=(死亡個數+15 min偏癱未恢復個數)/總個數，保護率=(未偏癱個數+15 min內偏癱恢復個數)/總個數，陰性組偏癱率大于等于80%說明造模成功。

陽性藥組及4個批號的注射用燈盞花素與陰性組比較，小鼠死亡個數以及偏癱未恢復數(15 min內)減少，差異有顯著統(tǒng)計學意義。2個批號的注射用燈盞花素與陰性組比較小鼠死亡個數以及偏癱未恢復數(15 min內)減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表1。

2.2 小鼠凝血時間實驗[4]取健康小鼠96只(雌雄兼有)，體重18～20g，隨機分為注射用燈盞花素組(6個批號共6組)，氯化鈉注射液組(陰性對照組)、鹽酸川芎嗪組(陽性對照組)共8組，每組12只。注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量(臨床人用劑量的30倍)給藥，陽性藥組給予200 mg·kg-1的血塞通注射液(臨床人用劑量的30倍)，各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，用玻璃毛細管插入小鼠眼內眥球后靜脈叢，深約4～5 mm，輕輕轉動至有血液流出，于載玻片兩端各滴一滴血，血滴直徑約5 mm，立即用秒表計時，每隔10s用清潔牙簽自血滴邊緣向里輕輕挑動一次，并觀察有無血絲挑起，從計時起至挑起血絲止，所歷時間即為凝血時間。

陽性藥血塞通注射液組及5個批號注射用燈盞花素與陰性組比較凝血時間明顯延長，差異有極顯著統(tǒng)計學意義，1個批號注射用燈盞花素與與陰性組比較凝血時間延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 注射用燈盞花素對小鼠體內血栓的藥效學研究

表2 注射用燈盞花素凝血時間的藥效學研究

2.3 小鼠常壓耐缺氧作用[4]取18～20g小鼠96只(雌雄兼有)，按體重隨機分為陰性組、陽性藥組以及6個批號的注射用燈盞花素組，共8組，每組12只。陰性組給予氯化鈉注射液，陽性藥組給予1.65 mg·kg-1的尼莫地平注射液(臨床人用劑量的25倍)，注射用燈盞花素組按25 mg·kg-1的劑量(臨床人用劑量的30倍)給藥。各組均為尾靜脈注射一次給藥，給藥體積0.2 mL/10g，給藥30 min后，將小鼠放入盛有15 g鈉石灰的廣口瓶內(每瓶放1只小鼠)，用凡士林涂抹瓶口蓋嚴，使之不漏氣，開始計時，以呼吸停止為指標，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。

陽性藥組尼莫地平注射液及4個批號注射用燈盞花素與陰性組比較喘息時間明顯延長，差異有極顯著統(tǒng)計學意義。2個批號注射用燈盞花素與與陰性組比較喘息時間延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 注射用燈盞花素常壓耐缺氧作用的藥效學研究

3 討論

3.1 中藥質量標準中含量測定的局限性 生物活性測定法是以藥物的生物效應為基礎，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設計，測定藥物有效性的一種方法，從而達到控制藥品質量的作用，其測定方法包括生物效價測定法和生物活性限值測定法[5]。

中藥的藥材來源廣泛、多變，制備工藝復雜，使得中藥制劑的質量控制相對困難。目前中藥質量標準中含量測定的建立與研究多半只是對中藥產品成分的穩(wěn)定性和可控性實行改進，并沒有與中藥的藥效建立直接的內在聯系[6]。尤其是用于臨床的中藥注射劑和危重病癥治療的中藥制劑，更應該保證每批產品具有可靠的生物活性[7]。本研究表明，雖然6批注射用燈盞花素中野黃芩苷含量均符合目前質量標準規(guī)定，但生物活性測定結果有所不同，顯示不同的生產工藝或同一企業(yè)不同的原料對中藥注射劑的有效性存在明顯影響。因此單純控制某些指標成分的理化分析并不能全面反映中藥注射劑產品的有效性，應該結合“生物活性測定”方法進行綜合評價。

3.2 分析結果和比較方法 本試驗研究根據《中國藥典》2015年版四部附錄“中藥生物活性測定指導原則”[5]設計，根據藥品的功能主治篩選生物活性測定方法。作為質量標準的生物活性測定方法，所選擇的檢測指標應當客觀、專屬性強，與功能主治相關，給藥途徑一般應與臨床用藥途徑一致，還應當操作簡便、成本低廉、檢測指標明確、靈敏度高、重現性好[8]。

小鼠體內血栓實驗，膠原蛋白和腎上腺素都是血小板聚集誘導劑，小鼠尾靜脈注射后誘發(fā)體內肺栓塞，血栓形成，導致偏癱和死亡。6個批號的注射用燈盞花素對血栓混合誘導劑誘導的急性血栓小鼠死亡個數以及偏癱未恢復數(15min內)減少，說明其對注射血栓混合誘導劑形成體內血栓模型的小鼠有一定的保護作用，但程度各不相同。該實驗中血栓誘導劑膠原蛋白和腎上腺素是微量注射，實際操作時對小鼠尾靜脈注射給藥要求較高，如果漏液實驗結果易出現偏差。

小鼠常壓耐缺氧實驗，缺氧對機體是一種劣性刺激，影響機體各種代謝，特別是影響機體的氧化供能，最終會導致機體的心腦等重要器官缺氧供能不足而死亡。野黃芩苷可提高機體的血氧利用率，降低機體耗氧量。同時可擴張血管(特別是冠脈和軟腦膜血管)[9]，改善微循環(huán)，增加供氧量，從而改善機體缺氧狀態(tài)，本實驗以小鼠在常壓缺氧條件下呼吸停止死亡為指標，研究注射用燈盞花素的耐缺氧作用。該實驗受人為因素影響小且較敏感。

小鼠凝血時間實驗，血瘀癥常有“濃粘凝聚“的血液流變異常，血瘀證患者血液運行不暢，易致血栓形成，血管栓塞，燈盞花素能改善血瘀證患者的血液流變性[10]，能夠抑制血小板功能，抑制血小板的粘附聚集和釋放，改善淤血癥高凝狀態(tài)，6個批號的注射用燈盞花素均可不同程度延長小鼠凝血時間，該實驗操作方法簡單易行，不需要復雜儀器。

綜上所述，篩選出適宜的注射用燈盞花素生物活性測定指標為小鼠常壓耐缺氧實驗和小鼠凝血時間實驗。生物活性測定方法的建立作為一項新的內容還應進行方法學驗證，包括精密度考察、方法適用性考察，如果經過驗證，能基本達到綜合控制與有效性相關的質量指標目的，則應將“生物活性測定”項目正式收載于質量標準中，并在今后的工作中不斷完善提高。