孫中美 李軍祥 路瓊瓊 丁龐華 史 瑞 趙興杰 譚 祥 姜 慧 毛堂友

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種發(fā)生于結(jié)、直腸黏膜的反復(fù)發(fā)作的非特異炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)，青黛可通過調(diào)節(jié)腸道菌群及短鏈脂肪酸丁酸水平，從而明顯改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，但是下游具體調(diào)控機(jī)制尚未闡明［2］。最新研究表明，G蛋白偶聯(lián)受體（GPRs）可作為丁酸的特異性受體，介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的屏障功能，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)［3］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，從GPRs信號(hào)入手，重點(diǎn)研究其下游Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)，以進(jìn)一步探究青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的SPF級雄性SD大鼠（180～220 g）購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK-2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～24℃；相對濕度50%～60%，12 h光照/黑暗循環(huán)，所有大鼠自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物 青黛配方顆粒購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司，藥物的制備及質(zhì)量檢測均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司完成。每日灌胃前，將青黛充分溶解于燒開的去離子水中，獲得青黛溶液；根據(jù)前期研究，本實(shí)驗(yàn)青黛劑量折合生藥量為 600 mg/kg［2］。

1.3 試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（MW36-50KDa；MP Biomedical，Burlingame，CA，USA），便潛血試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，廣東珠海），GPR41抗體（OmnimAbs，OM184469），GPR43抗體（OmnimAbs，OM173356），F(xiàn)OXP3抗體（OmnimAbs，OM279147），RORγ抗體（OmnimAbs，OM188985）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒（康為世紀(jì)，CW2582）；qPCR試劑盒：KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×）（KAPA Biosystems，KK4601）。

1.4 分組及干預(yù) 本實(shí)驗(yàn)是前期研究的延伸，大鼠分組、造模以及各組干預(yù)方法均如前報(bào)道［2］。24只健康的SPF級雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組、模型組、青黛組。模型組、青黛組大鼠自由飲用4.5% DSS水溶液以制備結(jié)腸炎模型，空白組大鼠自由飲用去離子水作為對照；同時(shí)青黛組大鼠予青黛（600 mg/kg）灌胃處理，空白組、模型組予去離子水灌胃處理。干預(yù)7 d后麻醉處死大鼠，取血及結(jié)腸組織。

1.5 Western Blotting法檢測結(jié)腸 GPR41、GPR43、RORγt、FOXP3蛋白表達(dá) 稱取大鼠結(jié)腸組織，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，充分勻漿后，4℃13 000 r/min離心20 min，提取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度；隨后電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；兔抗大鼠GPR41（1∶500）、GPR43（1∶500）、FOXP3（1∶500）、RORγ（1∶500）抗體，小鼠抗大鼠 β-Actin（1∶1 000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min；加入山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG（1∶1 000），室溫孵育 40min。TBST洗膜，ECL顯影，Gel Image system ver.4.00分析蛋白條帶灰度，計(jì)算目標(biāo)蛋白含量。

1.6 RT-qPCR檢測結(jié)腸孤核受體（RORγt）mRNA、叉頭蛋白P3（FOXP3）mRNA的表達(dá) Trizol法提取結(jié)腸組織總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，加入相應(yīng)引物按照試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，計(jì)算各組2-ΔΔCt值，求得目的基因相對于GAPDH基因的mRNA表達(dá)量。RORγt、FOXP3、GAPDH的引物序列及長度如表1。

表1 PCR引物序列

1.7 ELISA法檢測血清IL-10、IL-17含量 大鼠腹主動(dòng)脈取血后，4℃4 000 r/min離心10 min分離血清，應(yīng)用大鼠IL-10、IL-17酶聯(lián)免疫試劑盒，按照說明書檢測大鼠血清中IL-10、IL-17的濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 8.01對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以（）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且通過方差齊性檢驗(yàn)，進(jìn)行單因素方差分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊者則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠結(jié)腸GPR41、GPR43蛋白表達(dá)比較 見圖1，表2。與空白組比較，模型組GPR41、GPR43蛋白的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），經(jīng)過青黛治療后，GPR41、GPR43蛋白的表達(dá)較模型組明顯增加（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠結(jié)腸GPR41、GPR43蛋白的表達(dá)

表2 各組大鼠結(jié)腸GPR41、GPR43蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸GPR41、GPR43蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組青黛組n 8 8 8 GPR41 0.4609±0.0465 0.2183±0.0335△0.4405±0.0644*GPR43 0.4736±0.0170 0.2100±0.0962△0.4555±0.0176*

2.2 各組大鼠結(jié)腸RORγt、FOXP3 mRNA表達(dá)比較 見表3。與空白組相比，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸RORγt的基因表達(dá)增加，而FOXP3的基因表達(dá)下降；經(jīng)青黛干預(yù)后，RORγt mRNA的表達(dá)較模型組明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)OXP3 mRNA的表達(dá)則明顯升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠結(jié)腸RORγt、FOXP3 mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸RORγt、FOXP3 mRNA表達(dá)比較（±s）

組別空白組模型組青黛組n 8 8 8 RORγt mRNA 1.046±0.3632 1.456±0.2193 0.860±0.2070*FOXP3 mRNA 1.0400±0.3358 0.5140±0.2368 1.1700±0.4511*

2.3 各組大鼠結(jié)腸RORγt、FOXP3蛋白表達(dá)的比較 見圖2，表4。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸RORγt蛋白的表達(dá)顯著提高（P＜0.01），F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；青黛干預(yù)后，大鼠結(jié)腸RORγt蛋白的表達(dá)較模型組大鼠明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)OXP3蛋白的表達(dá)顯著提高（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠結(jié)腸RORγt、FOXP3蛋白的表達(dá)

表4 各組大鼠結(jié)腸RORγt、FOXP3蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸RORγt、FOXP3蛋白表達(dá)比較（±s）

組別空白組模型組青黛組n 8 8 8 RORγt 0.1906±0.1224 0.5453±0.0363△△0.3481±0.0147*FOXP3 0.6099±0.0662 0.2386±0.0657△△0.4827±0.0351**

2.4 各組大鼠血清IL-10、IL-17水平比較 見表5。與空白組相比，模型組大鼠血清IL-10含量明顯降低（P＜0.05），而血清IL-17含量明顯升高（P＜0.05），經(jīng)青黛干預(yù)后，大鼠血清IL-10含量較模型組大鼠明顯升高（P＜0.05），血清IL-17含量明顯降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠血清IL-10、IL-17水平比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠血清IL-10、IL-17水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組青黛組n 8 8 8 IL-10 43.60±9.015 30.28±4.962△43.37±2.244*IL-17 1.524±0.2742 2.034±0.1576△1.564±0.2319*

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎病變呈連續(xù)性分布，主要累及結(jié)腸、直腸的黏膜和黏膜下層；以腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重為主要癥狀并常伴有皮膚、關(guān)節(jié)等腸外表現(xiàn)［4-5］。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括環(huán)境因素、生活方式、遺傳因素、腸道菌群紊亂、免疫反應(yīng)失調(diào)等［6］。目前針對本病，西醫(yī)的主要治療方法包括水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素制劑、免疫抑制劑、生物制劑等，但存在不良反應(yīng)明顯、價(jià)格昂貴等問題。前期臨床研究證明中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎癥狀改善明顯，安全性好［7］。

青黛具有清熱解毒、涼血消斑的功效［8］，臨床廣泛應(yīng)用于皮膚黏膜疾病、潰瘍性結(jié)腸炎等的治療［9］。靛藍(lán)和靛玉紅為青黛的主要活性成分［10］。本項(xiàng)目組前期研究中利用高效液相法對青黛配方顆粒中靛藍(lán)、靛玉紅的含量進(jìn)行測定，分別為300.7、1.45 μg/mg，并且發(fā)現(xiàn)青黛能夠通過改善腸道菌群失調(diào)、提高短鏈脂肪酸，尤其是丁酸的含量，從而緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎［2］。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究GPR41/43及下游Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)，探究中藥青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的具體作用機(jī)制。

GPR41、GPR43屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，廣泛表達(dá)于脂肪組織、腸道、肝臟、脾臟等，是短鏈脂肪酸的主要受體。炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，GPRs可以調(diào)節(jié)炎性因子產(chǎn)生，抑制炎性T細(xì)胞的增殖，起到緩解炎癥的作用［11-12］。此外，有研究證明，GPR43在被短鏈脂肪酸激活后，能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化［13］，有效預(yù)防腸道炎癥，且在修復(fù)腸黏膜損傷中也發(fā)揮了重要的作用［14］。目前認(rèn)為Th17/Treg軸的平衡失調(diào)與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是治療潰瘍性結(jié)腸炎的重要靶點(diǎn)之一［15］。臨床研究證明，IBD患者外周血中Treg細(xì)胞顯著降低，Th17細(xì)胞顯著升高，兩者比例嚴(yán)重失衡［16］。Th17是一類CD4+T細(xì)胞，IL-6與TGF-β共同誘導(dǎo)RORγt的表達(dá)，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化［17］；Th17細(xì)胞由于具有分泌IL-17的能力而被命名，可以產(chǎn)生包括但不限于IL-17，IL-22和IL-23等細(xì)胞因子，具有募集中性粒細(xì)胞，并在感染部位促進(jìn)炎癥的作用，在眾多炎癥性疾病中扮演者重要的角色。Treg細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10等，抑制各種免疫細(xì)胞的活性，從而抑制過度的免疫反應(yīng)。Th17與Treg在炎癥和免疫反應(yīng)中起到了相反的作用［18］，維持兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠腸道短鏈脂肪酸受體GPR41、GPR43表達(dá)明顯降低，其下游Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)及細(xì)胞因子IL-17水平明顯升高，而Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的表達(dá)及細(xì)胞因子IL-10水平明顯降低；青黛的干預(yù)明顯逆轉(zhuǎn)了上述改變，與模型組大鼠相比，青黛組大鼠結(jié)腸GPR41、GPR43蛋白表達(dá)明顯升高，RORγt、IL-17表達(dá)明顯降低，F(xiàn)OXP3、IL-10表達(dá)量明顯升高，結(jié)合前期研究結(jié)果，表明青黛通過影響GPR41/43信號(hào)通路調(diào)節(jié)下游Th17/Treg平衡治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制。本項(xiàng)研究完善了青黛通過調(diào)節(jié)“菌群-代謝-免疫”信號(hào)軸治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，為青黛的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。