張麗華，林千涵，龐迎新

(山東大學齊魯醫(yī)院婦產科，濟南 250012)

子宮內膜癌(endometrial cancer，EC)是最常見的女性生殖系統腫瘤之一[1]。隨著人口老齡化和肥胖發(fā)病率的升高，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。約15%～20%的子宮內膜癌存在轉移或復發(fā)的高危因素，預后較差[3]。本課題組前期實驗發(fā)現，表觀遺傳因子溴結構域蛋白4(bromodomain-containing protein 4，BRD4)在內膜癌組織中的表達水平較正常內膜組織高，(+)-JQ-1(后文簡稱JQ1)是BRD4的抑制劑，能抑制包括子宮內膜癌在內的多種腫瘤的生長[4]。文獻報道，JQ1單一用藥有一定的局限性，如耐藥的產生和體內血藥濃度不穩(wěn)定[5-6]。Khalil等[7]在腫瘤免疫治療的近期綜述中，認為未來腫瘤的治療不是單一治療方式的應用，多靶點的聯合治療可能更有效[7]。本研究擬探討JQ1與醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate，MPA)聯合應用對子宮內膜癌細胞增殖和凋亡的影響，拓展子宮內膜癌治療的新領域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 子宮內膜樣腺癌細胞株Ishikawa和HEC-1A均購自上海中科院細胞庫。Ishikawa細胞表達孕激素受體(progestin receptor,PR)，被認為是孕激素敏感的內膜癌細胞系，HEC-1A細胞不表達PR，為孕激素耐藥的內膜癌細胞。

1.1.2 主要試劑 BRD4抗體購自美國Abcam公司，cleaved caspase-3、PARP抗體購自Santa Cruz biotechnology。mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt、GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology。Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒系BD公司產品。JQ1購自美國MedChemExpress公司，MPA購自Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，兩種藥物均用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后，分裝凍存。四甲基噻唑藍(methylthiazoletetrazolium，MTT)系碧云天公司產品。LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司。其余生化試劑均購自北京索萊寶技術有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 日本Olympus-LX70倒置顯微鏡;美國Nunaire公司細胞培養(yǎng)箱；德國Berthold Technologies公司酶標分析儀；美國BD公司的FACS Calibur流式細胞儀；美國BIORAD公司的電泳儀和電轉儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代 Ishikawa細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HEC-1A細胞用含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理后的細胞置于37℃含5% CO2的恒溫濕培箱。細胞覆蓋率達80%左右時進行傳代，0.25% EDTA胰酶消化傳代；次日待細胞貼壁后，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖率 將Ishikawa和HEC-1A細胞按103細胞/孔接種于96孔板，隔日更換含相應處理濃度JQ1和(或)MPA的培養(yǎng)基，對照組加等體積DMSO，每組設至少6個重復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。每孔加20μL MTT，使其終濃度為0.5mg/mL。培養(yǎng)4～6h棄上清，每孔加100μL DMSO，振蕩混勻，使結晶溶解。酶標儀490nm處測定吸光度。重復3次實驗，統計并分析細胞增殖率。

1.2.3 流式細胞術檢測不同處理后的細胞凋亡率 將子宮內膜癌細胞胰酶消化后接種于6孔板，濃度為2×104細胞/孔，培養(yǎng)24h，更換含相應處理濃度的JQ1和(或)MPA培養(yǎng)基，對照組加等體積DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細胞。用胰酶消化細胞，PBS洗2遍，100μL Annexin V-FITC binding buffer懸浮細胞，每組加Annexin V-FITC 5μL和PI 5μL，輕輕混勻，并單設一組無任何染料的作為陰性對照。室溫孵育15min，避光。期間上下顛倒混勻2～3次。流式細胞儀上機檢測，每份標本收集10000個細胞，檢測早期凋亡、晚期凋亡及壞死細胞的表達率。使用WinMDI 2.9軟件分析凋亡率。

1.2.4 Western blot 收集各藥物處理組的細胞，處理條件同前，PBS洗2遍，加細胞裂解液冰上裂解30min，4℃離心，收集上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。上樣，電泳，轉膜，脫脂奶粉室溫封閉1h，與相應蛋白的特異一抗4℃孵育過夜，洗膜，室溫孵育二抗45min，洗膜后用ECL試劑盒增強信號，凝膠成像儀曝光。

1.2.5 細胞干擾 BRD4 siRNA購自上海吉瑪，3條中選擇效果最佳1條進行后續(xù)實驗，序列為5'-CUCCCUGAUUACUAUAAGATT-3'。將細胞接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，待其密度至30%時，進行siRNA轉染。BRD4 siRNA濃度為5μL/孔(約50nmol/L)，對照組轉等量的陰性對照，所有操作均用DEPC水處理的槍頭及Ep管。按LipofectamineTM2000轉染說明，進行操作。培養(yǎng)4h，更換新鮮完全培養(yǎng)基。

2 結 果

2.1 JQ1聯合MPA對子宮內膜癌細胞增殖作用的影響 用濃度為1μmol/L JQ1單獨或聯合應用20μmol/L MPA處理子宮內膜癌Ishikawa及HEC-1A細胞48h，MTT法檢測細胞增殖能力，見圖1。在PR陽性的Ishikawa細胞中，與對照組相比，MPA組、JQ1組、MPA+JQ1組的細胞增殖率降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。析因方差分析結果顯示：MPA、JQ1抑制增殖率的主效應差異均有統計學意義(FMPA=476.54，FJQ1=69.64，P均<0.001)，MPA和JQ1聯合應用的效應差異有統計學意義(F=29.11，P=0.001)。在PR陰性的HEC-1A細胞中，與對照組相比，MPA組、JQ1組、MPA+JQ1組的細胞增殖率降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。析因方差分析結果顯示：MPA、JQ1抑制增殖率的主效應差異均有統計學意義(FMPA=13.620，P=0.006；FJQ1=37.240，P<0.001)，MPA和JQ1聯合應用的效應差異無統計學意義(F=3.798，P=0.087)。見圖1。

圖1 JQ1聯合MPA作用48h對子宮內膜癌細胞增殖率的影響

2.2 JQ1聯合MPA對子宮內膜癌細胞凋亡作用的影響 1μmol/L JQ1與20μmol/L MPA單獨或聯合作用于Ishikawa細胞48h，對照組、JQ1組、MPA組和JQ1+MPA組的細胞凋亡率分別為(4.46±2.81)%、(14.42±3.59)%、(28.52±2.38)%和(44.05±4.78)%。與對照相比，MPA組、JQ1組、MPA+JQ1組的細胞凋亡率增加，差異均有統計學意義(P均<0.05)。析因方差分析結果顯示： MPA、JQ1誘導凋亡率的主效應差異均有統計學意義(FMPA=211.55，FJQ1=51.165，P均<0.001)，MPA和JQ1聯合應用的效應差異有統計學意義(F=6.228，P=0.037)。Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，MPA組、JQ1組、MPA+JQ1組的caspase-3和PARP的剪切形式(cleaved caspase 3和cleaved PARP)增加，差異有統計學意義(P均<0.05)。析因方差分析結果顯示：MPA、JQ1上調cleaved caspase 3和cleaved PARP的主效應差異均有統計學意義(FMPA=441.679、119.250，FJQ1=203.201、1818.039，P均<0.001)，MPA和JQ1聯合應用的效應差異有統計學意義(F分別為9.146、15.850，P分別為0.016、0.004)。見圖2。

圖2 JQ1聯合MPA對子宮內膜癌細胞凋亡作用的影響

2.3 JQ1與MPA對子宮內膜癌mTOR/Akt通路的影響 1μmol/L JQ1與20μmol/L MPA單獨或聯合作用于Ishikawa細胞48h，與對照組相比，MPA組、JQ1組、MPA+JQ1組的p-mTOR和p-Akt表達降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。析因方差分析結果顯示：MPA、JQ1降低p-mTOR和p-Akt表達的主效應差異均有統計學意義(FMPA=464.023、56.765，FJQ1=260.576、142.719，P均<0.001)，MPA和JQ1聯合應用的效應差異有統計學意義(F=5.774、8.397，P=0.043、0.020)。見圖3。

2.4 BRD4沉默聯合MPA對子宮內膜癌細胞增殖的影響 轉染BRD4 siRNA的細胞內BRD4蛋白表達明顯降低(圖3)，表明干擾有效。與對照組相比，BRD4 siRNA組、MPA組、BRD4 siRNA+MPA組的細胞增殖率降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。析因方差分析結果顯示：MPA、BRD4 siRNA抑制增殖率的主效應差異均有統計學意義(FBRD4 siRNA=58.191，FMPA=241.199，P均<0.001)，MPA和BRD4 siRNA聯合應用的效應差異有統計學意義(F=24.453，P=0.001)。見表1及圖4。

圖3 JQ1與MPA對子宮內膜癌mTOR/Akt通路的影響

表1 BRD4 siRNA聯合MPA作用后各組細胞增殖率

圖4 BRD4 siRNA聯合MPA作用對子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖率的影響

3 討 論

目前在發(fā)達國家，子宮內膜癌的發(fā)病率已超過宮頸癌，其發(fā)病率在女性生殖系統惡性腫瘤中居于首位，其可能原因與肥胖、高血壓、人口老齡化、絕經延遲等有關[1-2]。年輕女性的子宮內膜癌發(fā)病率也較前增加，對于有生育要求的年輕患者，高效、大劑量孕激素治療是保守治療的主要手段[8]，而晚期子宮內膜癌患者亦可應用孕激素治療[9]。但子宮內膜癌患者因孕激素耐藥使得治療效果不佳，長期應用高效孕激素具有明顯毒副作用[10]。因此探索能增強子宮內膜癌對孕激素敏感性的新型藥物具有重要的臨床意義。

BET(bromodomain and extraterminal domain,BET)是一類含有溴結構域的蛋白質分子，結合乙酰化賴氨酸、募集其他轉錄因子，參與染色體重塑，促進目的基因的轉錄[11]。BET蛋白家族包括4個成員：BRD2、BRD3、BRD4和BRDT，其中以BRD4研究最多。BRD4是一種廣泛表達的核蛋白，含有兩個串聯的溴結構域(BD1和BD2)，結構上高度保守，但功能差異較大[12]。研究表明，BRD4在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中表達較高[13]；BRD4能募集多種轉錄因子，如NF-κB、AR、Twist、TP53、c-Myc、c-Jun、Stat3等調控Cyclin D、Wnt5a、Bcl2、IL-6以及HMOX1等下游基因的表達，從細胞周期、增殖、炎癥以及氧化應激反應等多方面參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[11,14]。JQ1是BRD4高效特異抑制劑，競爭結合BRD4轉錄激活結構域，使轉錄復合物從染色質解離，進而抑制下游結構基因的轉錄[15]。研究表明，JQl能顯著抑制血液系統腫瘤、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而且對II型子宮內膜漿液性癌也有顯著抑制作用[16-18]。但漿液性癌在子宮內膜癌中僅占1%～10%，JQ1是否對其他高危類型子宮內膜癌也有抑制作用，未見報道。

本課題組選用孕激素敏感型的Ishikawa細胞和孕激素非敏感型的HEC-1A細胞為實驗對象[19]，結果表明JQ1單獨作用能抑制Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的增殖，這表明BET抑制劑能抑制子宮內膜癌的生長。JQ1對多種腫瘤具有較好的抑瘤效果，但最近文獻報道，單純應用BET抑制劑在卵巢癌和前列腺癌中可通過激酶重編程或改變BRD4的去泛素化獲得耐藥性[5,20]。另有研究發(fā)現，JQ1不僅抑制BRD4，同時對BRD2和BRD3有一定作用，因BET家族不同成員在細胞內環(huán)境中所起的作用不同，使得JQ1療效具有不確定性[21]。因此，近年來科學家多次強調藥物聯合應用能達到減少給藥劑量，提高療效降低副反應的目的[7,22]。本課題在前期研究基礎上探討了JQ1聯合醋酸甲羥孕酮MPA對細胞增殖和凋亡的影響，發(fā)現在Ishikawa細胞中，JQ1聯合MPA能明顯增強細胞增殖抑制作用和凋亡作用，而對激素非敏感型細胞HEC-1A作用不顯著，這提示JQ1與MPA的作用可能與PR相關信號通路有關。 Lian等[23]對125例乳腺癌組織和50例癌旁組織進行免疫組化分析，發(fā)現BRD4與ER、PR表達呈負相關。ER、PR是否為BRD4下游的直接靶基因，JQ1的作用是否與直接調控PR基因的轉錄還是調控其相關通路，尚需進一步的實驗研究。

mTOR/Akt通路是細胞重要的存活通路，腫瘤細胞中常存在該通路的異?；罨?，抑制Akt通路常產生強大的抑瘤效果[24]。近年來研究表明，子宮內膜異位癥和子宮內膜癌中Akt通路與PR功能之間存在相互作用[25]。本課題應用MPA和JQ1聯合處理子宮內膜癌細胞發(fā)現，兩者均能抑制mTOR和Akt的磷酸化，聯用效果更為顯著，表明MPA和JQ1可能通過mTOR/Akt通路抑制細胞的增殖并誘導細胞凋亡，而且聯合給藥組抑制效果更強。

近年來藥物聯合治療惡性腫瘤越來越得到關注，本課題結果證明JQ1能抑制子宮內膜癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，與MPA聯用后內膜癌細胞增殖抑制和細胞凋亡增加，兩者發(fā)揮作用的機制可能與抑制mTOR/Akt通路相關。本實驗的結果初步探討了BRD4抑制劑JQ1和MPA聯合應用的抑癌機制，為今后進行深入的研究奠定了基礎。