侯 磊,王小新,李介巖,劉麗恒,張為遠(yuǎn),王 欣

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026)

胎兒水腫是指胎兒軟組織水腫及體腔積液，超聲表現(xiàn)為兩處及兩處以上的胎兒體腔異常積液，包括胸腔積液、腹腔積液、心包積液及皮膚水腫。胎兒水腫包括免疫性胎兒水腫與非免疫性胎兒水腫(nonimmune hydrops fetalis,NIHF)，其中非免疫原因占胎兒水腫原因的85%以上，發(fā)病率約為3/10000[1]。關(guān)于NIHF的診治，2014年美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)發(fā)布了相關(guān)指南[2]，2017年我國(guó)于《中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)布了相關(guān)指南[3]，其病因均首先提到染色體異常。染色體異常占NIHF病因的25%～70%[4]，特別是在妊娠早期發(fā)現(xiàn)水腫或并發(fā)其他胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)，胎兒非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)更高[5]。Santo等[6]研究顯示，24孕周前診斷的NIHF中，約50%的病因是染色體非整倍體異常，Turner綜合征及21-三體發(fā)病率最高，約占水腫胎兒的13%，其次18、13及其他染色體三體也可導(dǎo)致胎兒水腫。2018加拿大指南與2014美國(guó)母胎學(xué)會(huì)指南均建議所有水腫胎兒查胎兒染色體，不推薦行無(wú)創(chuàng)母血胎兒染色體篩查。與以往指南不同的是，2018加拿大指南更強(qiáng)調(diào)對(duì)水腫胎兒致病性拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNVs)的檢查。胎兒水腫的大樣本CNVs檢測(cè)研究較少，致病性CNVs檢出率差異較大，Su等[7]研究顯示，水腫胎兒的致病性CNVs檢出率為8.3%(3/36)。張志堅(jiān)等[8]研究顯示，46例水腫胎兒中，染色體異常檢出25例，其中12例為致病性CNVs，檢出率達(dá)26.1%。本文對(duì)146例非免疫性水腫胎兒進(jìn)行了核型聯(lián)合低覆蓋度大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(CNV sequencing，CNV-Seq)的檢測(cè)，以明確水腫胎兒異常CNVs檢出率。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧分析2013年1月1日至2016年12月31日于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診，胎兒超聲提示胎兒水腫且間接Coombs實(shí)驗(yàn)除外免疫性胎兒水腫的146例孕婦的臨床資料，如患者一般情況、超聲結(jié)果等。

1.2 方法

1.2.1 組織送檢 (1)絨毛診斷:妊娠11～13+6周經(jīng)腹活檢取絨毛4～5mg；(2)羊水診斷:妊娠18～23+6周經(jīng)腹羊膜腔穿刺取羊水30ml；(3)臍血診斷:妊娠24周后經(jīng)腹臍靜脈穿刺取血2ml；(4)胎兒組織送檢:死胎流產(chǎn)后取胎兒皮膚組織0.5cm3。既往研究顯示，CNV-Seq與微陣列技術(shù)有較好的一致性，且CNV-Seq需要樣本量較小，適用于取樣量較小的絨毛標(biāo)本，因此本研究采用CNV-seq作為CNVs的檢測(cè)方法。絨毛及胎兒組織標(biāo)本送檢CNV-Seq，羊水及臍血標(biāo)本除CNV-Seq外還送檢核型。介入性產(chǎn)前診斷均在超聲定位下進(jìn)行，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片及核型分析。孕婦術(shù)前常規(guī)遺傳咨詢并簽署知情同意書(shū)。羊水穿刺、臍帶血穿刺及絨毛穿刺均由本院產(chǎn)前診斷中心完成，送檢單位為本院遺傳實(shí)驗(yàn)室。CNV-seq檢測(cè)外送至貝瑞和康公司。

1.2.2 CNV-Seq 將50ng基因組DNA進(jìn)行片段化處理，獲得平均大小為300bp的DNA片段，參考文獻(xiàn)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)[9-10]，使用Illumina公司的HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，36bp單端測(cè)序，測(cè)序深度0.1倍，產(chǎn)生800萬(wàn)條測(cè)序序列。使用Burrows-Wheeler算法將所有測(cè)序序列與hg19基因組進(jìn)行比對(duì)分析[11]。根據(jù)文獻(xiàn)記載的數(shù)據(jù)處理和分析算法[12]，將最少20個(gè)測(cè)試樣本進(jìn)行內(nèi)部比較，互相作為參考。為了提高檢測(cè)靈敏度，以60kb為基本測(cè)序單元，對(duì)約500萬(wàn)條測(cè)序序列進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)序讀取密度的log2值為y軸，以相對(duì)連續(xù)的60kb測(cè)序單元為x軸，繪制CNV-seq檢測(cè)結(jié)果圖。依據(jù)每條染色體的長(zhǎng)度計(jì)算log2平均值。染色體拷貝數(shù)重復(fù)(3個(gè)拷貝)的log2理論值為log2[1.5]=0.58，染色體拷貝數(shù)缺失(1個(gè)拷貝)的log2理論值為log2[0.5]=-1.0。將CNV-seq檢測(cè)拷貝數(shù)重復(fù)的cut-off值設(shè)為>2.8(log2[1.4]=0.49)，拷貝數(shù)缺失的cut-off值設(shè)為<1.2(log2[0.6]=0.74)。

數(shù)據(jù)查詢DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC及PubMed公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源。致病性CNV根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳會(huì)與基因組學(xué)會(huì)(ACMG)診斷標(biāo)準(zhǔn)，將CNVs分為3大類5級(jí):(1)致病性CNVs(pathological copy number variations，pCNVs)；(2)良性CNVs；(3)臨床意義未明的CNVs；(4)可能致病性CNVs；(5)可能良性CNVs[13]。

1.2.3 數(shù)據(jù)收集 核對(duì)研究對(duì)象的一般情況、超聲結(jié)果及遺傳室結(jié)果并錄入電腦，整理分析其臨床信息。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及率描述，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 146例水腫胎兒的產(chǎn)前診斷方法包括絨毛穿刺57例，羊水穿刺68例，臍血穿刺11例，死胎流產(chǎn)后送檢胎兒組織10例；孕周為11～33周，中位數(shù)孕周為15周。146例水腫胎兒的染色體異常發(fā)生率為48.6%(71/146)，其中性染色體異常數(shù)量最多，為29例，21-三體19例，18三體13例，13-三體3例，其他染色體異常1例，致病性CNVs 6例(表1)。其他染色體異常1例，系38歲孕婦，13周因胎兒水腫、頸部水囊瘤行絨毛穿刺，46，XN，del(5)(p15,33)。

2.2 不同孕周水腫胎兒的染色體異常檢出 水腫胎兒的染色體異常檢出率隨孕周的增加而顯著降低，<14孕周、14～27孕周、≥28孕周孕婦的染色體異常檢出率分別為68.4%(39/57)、40.8%(31/76)和7.7%(1/13)(表1)。

表1 不同孕周水腫胎兒的染色體異常檢出

2.3 水腫胎兒并發(fā)其他超聲異常的染色體異常檢出 水腫胎兒最常合并的超聲結(jié)構(gòu)異常依次為NT/NF增厚、頸部水囊瘤及心臟異常，其染色體異常的檢出率分別為59.5%、59.2%及51.9%(表2)。

表2 水腫胎兒并發(fā)其他超聲異常的染色體異常檢出

2.4 水腫類型與胎兒染色體異常的檢出 146例水腫胎兒中，單純性皮膚水腫114例，皮膚水腫并發(fā)胸水15例，皮膚水腫并發(fā)腹水3例，皮膚水腫并發(fā)心包積液1例，皮膚水腫并發(fā)胸腹水13例，胸腹水1例；染色體異常檢出率分別為51.8%(59/114)、40.0%(6/15)、33.3(1/3)、0%(0/1)、38.5%(5/13)、0%(0/1)。

2.5 水腫胎兒的CNVs檢出情況 146例標(biāo)本中共檢出致病性CNVs 6例，CNV-Seq額外增加4.1%的染色體異常檢出(表3)。6例CNVs包括Moyamoya disease 4綜合征2例，Cri du chat綜合征1例及chromosome 17p13.3 重復(fù)綜合征1例，其余2例為10號(hào)染色體重復(fù)及Y染色體的缺失(表3)。

1例臨床意義未明病例，32歲孕婦，因NT 4.8mm、胎兒水腫于孕12周行絨毛穿刺，結(jié)果提示3p12.1(85100001-86140000)存在重復(fù)，重復(fù)片段大小為1.04Mb，經(jīng)查詢DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源，未找到與該片段相關(guān)的明確致病信息和文獻(xiàn)報(bào)道，臨床意義未明。

表3 水腫胎兒致病性CNVs病例

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，水腫胎兒染色體異常發(fā)病率最高的是性染色體異常，共29例，其中26例為T(mén)urner綜合征，2例為T(mén)urner綜合征嵌合:45,X(40%)/46,XN(60%)及45，X(40%)/46，XY(60%)，1例為46，XX(25%)/46，XY(75%)。本研究發(fā)現(xiàn)的CNVs異常中也有2例為X染色體片段缺失，稱Moyamoya disease綜合征。以上均提示X染色體缺失是最常見(jiàn)的導(dǎo)致胎兒水腫的病因。Laterre等[14]研究顯示，33例染色體異常中Turner綜合征或嵌合型Turner綜合征18例，Turner綜合征的水腫從胎兒期延續(xù)到嬰兒期，嬰兒期淋巴管水腫的發(fā)生率97%，多表現(xiàn)為手足背水腫[15]。X染色體短臂上有淋巴管生成基因，鄰近Xp21.2～Xp21.1，推測(cè)Turner胎兒同源基因的不充足使淋巴管發(fā)育不良，產(chǎn)生淋巴水腫，水腫的機(jī)械力作用于淋巴系統(tǒng)鄰近的組織或器官，影響其發(fā)育而導(dǎo)致器官的畸形[16]。

本研究顯示，21-三體是除性染色體異常外導(dǎo)致胎兒水腫的最常見(jiàn)原因，共發(fā)現(xiàn)19例，檢出率為13%，與以往研究一致。Mardy等[17]研究發(fā)現(xiàn)1例21號(hào)染色體微重復(fù)的水腫胎兒(21p11.2q22.3)，提示21號(hào)染色體與水腫的產(chǎn)生關(guān)系密切。有學(xué)者認(rèn)為，21-三體胎兒多合并心臟畸形，心臟畸形導(dǎo)致循環(huán)障礙從而引發(fā)水腫。但本研究中19例21-三體胎兒中，只有2例超聲提示心臟結(jié)構(gòu)異常，因此21-三體導(dǎo)致水腫的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

以往研究報(bào)道涉及胎兒水腫的CNVs異常包括Miller-Dieker 綜合征、Pena-Shokeir、Digeorge綜合征、5P-綜合征等[18]。在染色體及CNVs無(wú)異常的病例中，尚需除外單基因病，如代謝病及RAS通路疾病等，RAS通路疾病是涉及絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(RAS-MARK)中的PTPN11、BRAF等16個(gè)基因的一組單基因病，胎兒表現(xiàn)為頸部半透明增厚和(或)水囊瘤、羊水過(guò)多、胎兒水腫、心臟缺陷和腎臟異常，其中Noonan綜合征是最常見(jiàn)的疾病，有研究對(duì)95例核型及CNVs無(wú)異常的上述表型胎兒進(jìn)行基因檢測(cè)，檢出Noonan綜合征10例[19]。

綜上所述，染色體病仍是非免疫性水腫胎兒中常見(jiàn)的原因，特別是孕14周前的水腫胎兒。致病性CNVs在水腫胎兒中占有相當(dāng)?shù)谋壤?，在產(chǎn)前診斷中須重視此項(xiàng)檢測(cè)。