劉玉婷，敖雯雯，廖海民，陳琳，韓淑梅

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

隨著工業(yè)化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，電子垃圾和工業(yè)廢棄物大量排放，同時礦業(yè)開采、電池制造等工業(yè)廢水持續(xù)侵蝕土壤，造成了現(xiàn)今土壤重金屬污染形勢日趨嚴(yán)峻的局面，重金屬元素含量表現(xiàn)出不同程度的富集[1-2]。土壤中的鎘（Cd）由于可溶性強、來源廣泛且易被植物吸收后進(jìn)入食物鏈并最終導(dǎo)致人體致毒致癌，成為首當(dāng)其沖的重金屬污染源，引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[3-4]。有研究表明，我國耕地鎘污染率高達(dá)25.20%，遠(yuǎn)超鉛、銅、鋅、鎳和鉻等土壤重金屬元素[5]。目前，可用于修復(fù)土壤鎘污染的方法主要有化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)，生物修復(fù)中的植物修復(fù)具備能耗低、效率高且二次污染少等特點，被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的修復(fù)措施[6]。孔雀草（Tagetes patula L.）屬于菊科萬壽菊屬一年生草本植物，是一種耐貧瘠、管理成本低的觀賞性植物，具有很強的Cd耐受性，屬于Cd超富集植物[7]。然而在不施加任何外源強化劑的條件下，孔雀草對土壤中Cd的吸收易受濃度限制、耐受有限。為提升土壤鎘污染修復(fù)能力，引入適宜的強化劑已成為有力的促進(jìn)措施[8]。

水楊酸（Salicylic Acid，SA）被認(rèn)為是受脅迫條件下植物體誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的信號分子，能通過多種途徑減緩Cd脅迫的毒害作用，包括調(diào)節(jié)植物生長、減少Cd吸收及其分布、保護(hù)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性以及強化植物體抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)的功能[9-10]。Shi等人[11]在對Cd脅迫下生長的火麻仁幼苗外施SA處理后，測定其生長參數(shù)、Cd累積量、光合作用強度等參數(shù)后證實SA能有效抵抗Cd脅迫對植物生長造成的抑制作用。Ting等人[12]選擇Cd敏感及Cd耐受型番茄植株作為研究對象，發(fā)現(xiàn)SA與Fe離子及生長促進(jìn)類微生物聯(lián)合使用也能促進(jìn)植物根、莖及葉生物量的累積。當(dāng)前針對SA處理植物修復(fù)鎘污染的研究雖多，但直觀了解水楊酸處理對Cd脅迫下的孔雀草細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的研究卻并不多見。文章探究了SA處理對Cd脅迫下的孔雀草組織細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響，為后期鎘污染治理研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 鎘污染土壤

供試土壤為營養(yǎng)有機土，不含金屬物質(zhì)。按照Cd濃度100 mg/kg稱取氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）溶于適量蒸餾水中并澆灌土壤，蒸餾水處理組作為陰性對照組，每日攪動，平衡2個月后待用。

1.1.2 鎘超富集植物孔雀草

選取大小均一且飽滿的孔雀草種子用75%乙醇消毒2 min，蒸餾水沖洗數(shù)次后浸種24 h，播種于穴盤中。待孔雀草長出4片葉后，選取長勢一致的幼苗移入已平衡完畢的各處理組土壤中。

1.2 試劑與儀器

智能內(nèi)校分析天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；HHQ-2508 輪轉(zhuǎn)式切片機,金華市華?？平虄x器廠；KD-H 烘片機，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；BX53DIC+DP73 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯有限公司。

乙醇、冰乙酸，分析純，成都市科龍化工試劑廠；甲醛、二甲苯，分析純，西隴化工股份有限公司；番紅、固綠，北京索萊寶科技有限公司；中性樹膠，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鎘標(biāo)準(zhǔn)品，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水楊酸（SA）處理

配制濃度分別為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L的水楊酸溶液（記為T1、T2、T3及T4組），待孔雀苗移栽后，每隔5 d噴施各處理組SA溶液，且每個處理組每次噴施的量保持一致，移栽50 d后收獲。同時設(shè)置無Cd脅迫且不施加SA處理（TC）和Cd脅迫下生長且不施加SA處理（T0）的兩組對照。每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)保苗2株，用于后續(xù)制片及觀察。

1.3.2 孔雀草植株各組織石蠟切片

對“1.3.1”植株進(jìn)行取材后，將各組材料置于FAA固定液中固定，乙醇逐級脫水，番紅預(yù)染，二甲苯透明，石蠟包埋。再經(jīng)切片、脫蠟及復(fù)水等操作后，1%番紅及1%固綠雙重染色，中性樹膠封片。OlympusBX53生物顯微鏡鏡檢，并于數(shù)碼成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸處理對孔雀草根顯微結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，正常環(huán)境下不受鎘脅迫也無外源SA處理影響的孔雀草根的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)應(yīng)如對照TC組所示，主要由表皮、皮層、中柱三部分組成。其中，表皮細(xì)胞排列緊密，皮層由多層薄壁細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞排列較疏松，中柱主要由初生木質(zhì)部、初生韌皮部及木韌間薄壁細(xì)胞等部分組成，細(xì)胞排列規(guī)則，整體顯微結(jié)構(gòu)完整。對照T0組，生長于含鎘污染土壤中，且不經(jīng)過水楊酸噴施處理，表皮細(xì)胞明顯破裂，細(xì)胞壁增厚，皮層薄壁細(xì)胞解體，中柱部分僅木質(zhì)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)保留較完整，且細(xì)胞壁也有增厚情況。說明在濃度為100 mg/kg鎘污染條件下，孔雀草根受到明顯的毒害作用。而SA處理后（T1、T2、T3與T4）的各組細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的完整性較T0組都有提升，尤其T2組除皮層薄壁細(xì)胞形狀欠規(guī)則且排列較疏松以外，與未受鎘污染脅迫的Tc組的細(xì)胞形態(tài)組織結(jié)構(gòu)完好程度基本一致。

圖1 孔雀草各處理組根石蠟切片顯微結(jié)構(gòu)（10×物鏡）

在對施加外源SA處理的各組材料進(jìn)行觀察對比，各組孔雀草根的表皮細(xì)胞排列緊密性及完好程度按照T2、T3、T1、T4的順序逐漸降低，皮層薄壁細(xì)胞逐步解體，同時中柱各細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性也隨之降低。綜上說明，對于提升孔雀草根組織結(jié)構(gòu)完整性和抗損傷修復(fù)能力而言，各SA處理組的表現(xiàn)為T2＞T3＞T1＞ T4。

2.2 水楊酸處理對孔雀草莖顯微結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，正常生長條件下孔雀草莖的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)由表皮、皮層、維管柱3部分組成。表皮是莖最外層形狀略扁平的細(xì)胞緊密排列而成，且細(xì)胞外壁有一層角質(zhì)層；皮層位于表皮與維管柱之間，主要由薄壁細(xì)胞組成，排列較疏松，靠近表皮的為厚角組織，由幾層不均勻增厚活細(xì)胞組成；維管柱中韌皮部、木質(zhì)部、髓和髓射線等組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、界限清晰。T0組中表皮組織細(xì)胞出現(xiàn)明顯破損，髓及髓射線的薄壁細(xì)胞發(fā)生裂解和解體；維管束中韌皮部及木質(zhì)部間存在組織分離現(xiàn)象，間隙較大。細(xì)胞的規(guī)則性和完整性顯著降低，僅能基本保持細(xì)胞的完整性。同時Cd脅迫各組最外層角質(zhì)層及維管束細(xì)胞壁均有加厚。

圖2 水楊酸處理對孔雀草莖顯微結(jié)構(gòu)的影響 (10×物鏡)

對各處理組莖組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析可以看出，T2組各部分組織結(jié)構(gòu)完好，維管束細(xì)胞充盈排列致密，沒有明顯損傷；而后依T3、T1、T4順序觀察，各組孔雀草莖的表皮細(xì)胞都出現(xiàn)不同程度受損，皮層細(xì)胞愈加疏松不規(guī)則，髓部細(xì)胞逐漸解體破裂，維管束間組織分離現(xiàn)象也越愈突出。說明以上各組材料所受鎘脅迫影響逐漸增大，即各SA處理組緩解鎘脅迫對孔雀草莖組織結(jié)構(gòu)損傷的效果表現(xiàn)為T2＞T3＞T1＞ T4。

2.3 水楊酸處理對孔雀草葉片顯微結(jié)構(gòu)的影響

如圖3所示，Tc組孔雀草葉片腹面及背面分別由一層緊密排列的上下表皮細(xì)胞構(gòu)成，緊挨上表皮的柵欄組織呈柵欄狀緊密排列，其下方海綿組織細(xì)胞形狀不規(guī)則，排列疏松。葉片主脈部分主要由上表皮下方的維管束、薄壁組織及厚角組織組成。在100 mg/kg鎘毒害條件下，T0組葉片表皮細(xì)胞及主脈薄壁細(xì)胞出現(xiàn)大面積破損，柵欄組織呈現(xiàn)出明顯的不均勻積聚增厚的現(xiàn)象，柵欄組織內(nèi)部、柵欄組織與海綿組織間的間隙也顯著增大。

圖3 水楊酸處理對孔雀草葉顯微結(jié)構(gòu)的影響（20×物鏡）

將各SA處理組間葉片組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的對比分析后可以看出，自T2、T3、T1、T4順序觀察，T2組在同樣受到100 mg/kg鎘脅迫，但施加0.2 mmol/L SA處理條件下，孔雀草葉片基本不受鎘毒害影響，各部分組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完好。而后各組均有細(xì)胞解體現(xiàn)象，且愈加明顯，并逐步出現(xiàn)表皮細(xì)胞解體、局部柵欄組織增厚及組織間隙增大的情況。圖3證明水楊酸各處理組中孔雀草葉片所受鎘脅迫毒害程度大小為T4＞T1＞T3＞T2。即各組水楊酸對孔雀草葉片抗性修復(fù)能力的促進(jìn)效果表現(xiàn)為T2＞T3＞T1＞ T4。

重金屬毒害會影響植物的生長發(fā)育、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、物質(zhì)代謝及體內(nèi)抗性酶的活性。在鎘污染土壤中，可溶性Cd2+被孔雀草根系吸收進(jìn)入植株組織細(xì)胞中，可與植物體新陳代謝過程中的關(guān)鍵活性酶蛋白上的金屬元素發(fā)生競爭取代反應(yīng)引起酶催化反應(yīng)受阻，干擾正常代謝過程，從而強烈抑制植物體的正常生長代謝，造成植株發(fā)育遲緩、葉片萎黃、根系壞死以及細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，完整性明顯降低。這也是本實驗結(jié)果中出現(xiàn)各類細(xì)胞變形解體、組織分離、細(xì)胞形狀及排列不規(guī)則等現(xiàn)象的主要原因。有研究證明，環(huán)境非生物脅迫會影響植物的顯微結(jié)構(gòu)，如張曉勇的研究表明，在冷害脅迫下，枇杷表皮細(xì)胞會發(fā)生擠壓、表皮斷裂、細(xì)胞壁降解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊等現(xiàn)象[13]。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)鎘脅迫下的各組孔雀草根表皮及中柱部分尤其木質(zhì)部細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞壁增厚現(xiàn)象，莖的最外層角質(zhì)層及維管束細(xì)胞壁也有加厚，同時葉片主脈維管束中均有不同程度的木質(zhì)部細(xì)胞壁增厚和柵欄組織的積聚增厚。Vollenweider等人[14]曾發(fā)現(xiàn)鎘處理樣品的大部分組織存在細(xì)胞壁明顯增厚現(xiàn)象，且葉片的柵欄組織和海綿組織在鎘處理樣品中表現(xiàn)出活力下降、表皮細(xì)胞塌陷及葉肉細(xì)胞部分壞死的情況。張樹森等[15]的研究表明，在Pb、Cu、Zn、Cd、Hg等重金屬脅迫下,紫葉稠李的解剖結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出柵欄薄壁細(xì)胞組織厚度逐漸增大、海綿組織薄壁細(xì)胞逐漸分化、柵欄組織與海綿組織的比值增大等一系列變化。造成孔雀草細(xì)胞壁增厚的主要原因可能是組織通過細(xì)胞壁吸附Cd2+，并通過沉積作用阻止重金屬進(jìn)入細(xì)胞，從而引起Cd2+在細(xì)胞壁上的累積[16]。此外，施加SA也可誘導(dǎo)細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量升高，致使細(xì)胞壁增厚，從而增強細(xì)胞抵御病原入侵的能力。

正常條件下，植株在受到鎘毒害時自身也會有相應(yīng)的耐受和抵抗機制，鎘脅迫發(fā)生的同時植物體內(nèi)會誘導(dǎo)脅迫響應(yīng)蛋白基因的表達(dá)，產(chǎn)生抗性蛋白，提高植株防衛(wèi)鎘毒害的能力。這也是實驗中孔雀草根、莖、葉組織在施加SA處理后，其顯微結(jié)構(gòu)的完整性得到一定程度提升的原因。但不同濃度的SA處理緩解鎘毒害的效果不盡相同，各處理組整體表現(xiàn)為T2＞T3＞T1＞T4。說明T2組在100 mg/kg Cd+0.2 mmol/L SA時，孔雀草生長出現(xiàn)增效效應(yīng)。即適宜濃度的SA處理對一定程度的鎘毒害有顯著緩解作用。因此在一定濃度的鎘污染土壤中施予適宜濃度的SA來種植孔雀草是提升土壤鎘污染修復(fù)能力的一個有力強化措施，這對于未來進(jìn)一步將孔雀草應(yīng)用于治理土壤重金屬鎘污染具有推動作用，具備一定的經(jīng)濟(jì)效益及生態(tài)效益。

實驗過程中，Cd+SA組合對孔雀草的影響可能存在拮抗機制，兩者交互作用復(fù)雜。同時，SA對鎘污染毒害的緩解作用也是有限的，通過考察4個SA濃度點與100 mg/kg Cd對孔雀草的交互影響，發(fā)現(xiàn)在0.2 mmol/L的SA處理時，各組織顯微結(jié)構(gòu)完整性較好，而后隨SA濃度升高完整性反有降低，并不排除過高濃度SA反而會給孔雀草顯微結(jié)構(gòu)造成損傷的可能。

3 結(jié)論

通過觀察孔雀草組織的顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在100 mg/kg鎘污染土壤中，緩解Cd毒害的最佳SA濃度為0.2 mmol/L。然而僅停留在顯微結(jié)構(gòu)的觀察是不夠的，后期還可增加多影響因素的考查，并結(jié)合進(jìn)一步的電鏡觀察研究，以期深度了解SA處理對孔雀草超微結(jié)構(gòu)的影響，從亞細(xì)胞水平揭示SA增強孔雀草鎘抗逆性的機理。