王菊寧，霍宇寧，任淑婷

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061；2.西安培華學(xué)院，陜西西安 710125）

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）發(fā)病過(guò)程中最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]，其主要病理改變之一是腎小球系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的增多最終導(dǎo)致的腎小球硬化。高血糖是引發(fā)DN發(fā)生和發(fā)展的主要因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，硒具有類胰島素樣作用，能增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，促進(jìn)靶組織利用葡萄糖，在降血糖的同時(shí)不增加血液中的胰島素水平[2]。本研究擬探討胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉在高糖環(huán)境下對(duì)腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎小球系膜細(xì)胞株（Human Mesangial Cell，HMC），西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科付榮國(guó)教授提供；胰島素，徐州萬(wàn)邦金橋制藥有限公司；亞硒酸鈉，西安赫特生物公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），以色列 Biological Industries；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK8），碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、甘露醇、二甲亞砜，美國(guó)Sigma。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇HMC進(jìn)行培養(yǎng)，制備0.5×105cell/mL的HMC細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后更換含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，然后再給予細(xì)胞不同處理。

1.3 葡萄糖誘導(dǎo)HMC增殖模型的建立

采用濃度為 0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L 和35 mmol/L的葡萄糖溶液處理HMC細(xì)胞，觀察處理24 h后細(xì)胞增殖情況確定誘導(dǎo)HMC增殖的最佳葡萄糖濃度。為了觀察高糖引起溶液滲透壓增高后是否對(duì)細(xì)胞增殖有影響，除未給予任何處理的正常對(duì)照組（Control）外，同時(shí)增設(shè)與最佳葡萄糖濃度相當(dāng)?shù)?0 mmol/L高滲甘露醇組（Mannitol），觀察HMC在葡萄糖和高滲甘露醇作用下48 h內(nèi)的增殖情況。

1.4 胰島素或胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉抑制HMC增殖

為了明確胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制作用及其最佳抑制劑量，以未給予任何處理的空白對(duì)照組（Control）和30 mmol/L甘露醇處理的高滲甘露醇組（Mannitol）作陰性對(duì)照，在最佳葡萄糖濃度誘導(dǎo)HMC增殖的條件下，再給予3個(gè)不同濃度（30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL）的胰島素處理，與葡萄糖單獨(dú)處理的高糖模型組（Glucose）比較，觀察胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)48 h內(nèi)細(xì)胞增殖的抑制作用，篩選出胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖抑制作用的最佳處理濃度。

在得到最佳胰島素處理濃度后，基于以往對(duì)胰島素與亞硒酸鈉的最佳配伍研究[3]，分別給予最佳濃度胰島素單獨(dú)處理（Insulin）、或胰島素與相應(yīng)濃度亞硒酸鈉聯(lián)用處理（Insulin+Sodium Selenite）高糖誘導(dǎo)后的HMC，觀察胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對(duì)高糖誘導(dǎo)48 h內(nèi)細(xì)胞增殖的抑制效果。

1.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 不同新培養(yǎng)基和10 基和同時(shí)間點(diǎn)后溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5 XML Project軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組間比較利用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖誘導(dǎo)HMC的增殖

通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性，明確高糖對(duì)HMC的增殖作用。用不同濃度的葡萄糖處理HMC 24 h后，檢測(cè)HMC的相對(duì)細(xì)胞活性，結(jié)果如圖1a所示。隨著葡萄糖濃度（5～35 mmol/L）的增加，相對(duì)細(xì)胞活性均較正常對(duì)照組（0 mmol/L Glucose）顯著增加（P＜0.05）；且當(dāng)葡萄糖濃度為30 mmol/L時(shí)，細(xì)胞相對(duì)活性達(dá)到峰值。因此，后續(xù)研究選用30 mmol/L葡萄糖作為誘導(dǎo)HMC增殖的最佳濃度。

以未給予任何處理的細(xì)胞作為正常對(duì)照組（Control），檢測(cè)30 mmol/L葡萄糖（Glucose）和甘露醇（Mannitol）誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)HMC相對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果如圖1b所示。與正常對(duì)照組和高滲甘露醇組相比，高糖（30 mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)HMC 24 h、36 h和48 h的相對(duì)細(xì)胞活力均顯著性上升（P＜0.05），且呈時(shí)間依賴性；而高滲甘露醇組與正常對(duì)照組相比，其相對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 高糖誘導(dǎo)HMC增殖情況

2.2 胰島素或胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對(duì)高糖環(huán)境下HMC增殖的影響

如圖2a和2b所示，胰島素處理后24 h和48 h，與高糖模型組（Glucose）比較，3個(gè)不同濃度胰島素處理組的相對(duì)細(xì)胞活力均顯著性降低（P＜0.05），其中100 mU/mL胰島素組的細(xì)胞活力最低，提示胰島素可有效抑制高糖誘導(dǎo)HMC的增殖，且以100 mU/mL胰島素處理組的抑制效果最明顯。

圖2 胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的影響

基于以往對(duì)胰島素與亞硒酸鈉的最佳配伍研究[3]，選擇100 mU/mL胰島素聯(lián)合500 ng/mL亞硒酸鈉作為胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。圖3結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，與高糖模型組（Glucose）相比，100 mU/mL胰島素處理組（Insulin）和100 mU/mL胰島素+500 ng/mL亞硒酸鈉處理組（Insulin + Sodium Selenite）的相對(duì)細(xì)胞活力均明顯下降（24 h、36 h、48 h均P＜0.05）；與單獨(dú)胰島素處理組（Insulin）相比，胰島素+亞硒酸鈉組（Insulin + Sodium Selenite）的相對(duì)細(xì)胞活力降低更顯著（48 h，P＜0.05）。由此可見，胰島素及胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉均可顯著抑制高糖環(huán)境下HMC的異常增殖，而胰島素聯(lián)合亞硒酸的抑制效果優(yōu)于同等劑量單獨(dú)胰島素。

圖3 胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的影響

3 結(jié)論

腎小球系膜細(xì)胞的異常增殖是DN的一個(gè)重要病理特征。本研究證實(shí)，30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)HMC的細(xì)胞增殖顯著且具有時(shí)間依賴性，而不同濃度（30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL） 的 胰 島素可顯著抑制高糖誘導(dǎo)HMC的異常增殖，使細(xì)胞活性顯著下降，其中100 mU/mL胰島素對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制效果最為顯著，該濃度胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉按1∶5使用后，對(duì)高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制效果更加顯著，提示胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉可能會(huì)對(duì)糖尿病腎病引起的腎小球硬化具有重要的防治作用。