楊愛玉，徐健全

（江西現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330095）

石油化工生產(chǎn)的塑料廢物污染是世界環(huán)境難題[1]，大部分塑料一次性使用后即被丟棄。塑料產(chǎn)品物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其在自然環(huán)境里可能數(shù)十年甚至數(shù)百年不會(huì)被分解[2-3]，并形成“白色污染”威脅生態(tài)環(huán)境[4-6]。目前，處理廢棄塑料的主要方法有填埋法、焚燒法、化學(xué)處理法等。采用傳統(tǒng)生活垃圾填埋技術(shù)治理白色污染，由于非降解塑料為惰性結(jié)構(gòu)，掩埋地下很難被生物降解，不僅影響土壤結(jié)構(gòu)，還具有污染地下水、投資大、運(yùn)行費(fèi)用高、占地面積大等缺點(diǎn)；而廢棄塑料焚燒法雖然徹底，但是對(duì)大氣造成了嚴(yán)重污染；塑料的化學(xué)分解技術(shù)是在溶劑和催化劑存在的條件下，使高分子聚合物分解為單體進(jìn)行回收利用，其費(fèi)用高并會(huì)產(chǎn)生二次污染[7]。

黃粉蟲幼蟲目前用于動(dòng)物飼料、食品加工、醫(yī)藥保健品以及抗菌蛋白等，此外在環(huán)保中發(fā)揮一定作用。Yang等人[8-9]的研究發(fā)現(xiàn)，100只黃粉蟲幼蟲每天可以吃掉34～39 mg的泡沫塑料，并將塑料轉(zhuǎn)變?yōu)楣┢渖L(zhǎng)所需的脂肪和CO2。在此過程中，幼蟲體內(nèi)的腸道微生物發(fā)揮了主導(dǎo)作用。Yang等人[9]從其腸道內(nèi)分離出的一株微小桿菌在60 d內(nèi)可降解7.4%±0.4%的塑料，Gilan等人[10]分離出能夠降解聚苯乙烯塑料的菌株C208，其降解率可達(dá)8%。利用黃粉蟲腸道微生物對(duì)白色污染進(jìn)行治理的生物降解法，是利用由生長(zhǎng)在塑料表面或內(nèi)部的微生物新陳代謝作用，其降解過程能耗低，降解產(chǎn)物為生物體自然代謝產(chǎn)物，不會(huì)造成二次污染，可以有效避免傳統(tǒng)的填埋法、焚燒法、化學(xué)處理法等的缺點(diǎn)，是一種綠色環(huán)保的“白色污染”處理工藝。本研究通過喂食黃粉蟲PVC塑料及對(duì)其腸道微生物進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，探究黃粉蟲對(duì)PVC塑料的降解能力及其腸道中能代謝PVC塑料的微生物，為進(jìn)一步利用生物法降解PVC塑料作初步嘗試。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

黃粉蟲（Tenebrio molitor）幼蟲購(gòu)于千花伴花鳥市場(chǎng)，幼蟲體長(zhǎng)20～25 mm。PVC塑料膜為塑洋牌，臨沂市奔多包裝有限公司。

1.2 試劑和儀器

蛋白胨、酵母膏、瓊脂、NaCl、KH2PO4、ZnSO4·7H2O、K2HPO4、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NH4NO3，化學(xué)純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

H2P-250恒溫震蕩培養(yǎng)箱，上海精宏；UV-1700紫外-可見分光光度計(jì)，上海美析；AUW120D精密電子天平，島津；YX280A滅菌鍋，上海三申；SW-CJ-2D無菌操作臺(tái)，上海尚凈。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH值調(diào)至7.0。

以PVC為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基：KH2PO40.700 g、ZnSO4·7H2O 0.002 g、K2HPO40.700 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.700 g、MnSO4·H2O 0.001 g、NH4NO31.00 g，PVC塑料膜片，蒸餾水定容至1 L，pH值調(diào)至7.0。

培養(yǎng)條件：所有用品在105 kPa滅菌30 min，固體培養(yǎng)基在25 ℃恒溫培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基于25 ℃震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 r/min。

1.4 黃粉蟲的飼養(yǎng)

在室溫（25±2）℃條件下飼養(yǎng)黃粉蟲，挑選體態(tài)相似的黃粉蟲作為一組，同時(shí)做2組平行，以干面條為食物飼養(yǎng)4 d，使其恢復(fù)至最佳生理狀態(tài)，之后以PVC膜為唯一食物飼養(yǎng)12 d，期間每隔4 d喂食少量蔬菜葉作為水分補(bǔ)充，每2 d對(duì)PVC塑料膜和蟲體進(jìn)行稱重并記錄。另取若干黃粉蟲喂食麥麩作為對(duì)照。

1.5 黃粉蟲腸道微生物的分離和純化

按照文獻(xiàn)[11]的方法，取PVC塑料膜飼養(yǎng)12 d后的黃粉蟲幼蟲，在超凈工作臺(tái)上將蟲體浸泡在75%醫(yī)用酒精里1 min，用SAB緩沖液反復(fù)漂洗至白色，無菌蒸餾水沖洗3次，用無菌解剖器具取出腸道，置于裝有10 mL滅菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分震蕩10 min。

取震蕩后的腸道內(nèi)容物溶液1 mL，加入裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25 ℃、100 r/min條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。3 d后，將富集培養(yǎng)好的菌液，以1%的接種量接入以PVC為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，期間每3 d用紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm（OD600）波長(zhǎng)下測(cè)定一次菌體生長(zhǎng)情況，51 d后測(cè)定PVC塑料膜重量。

在菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)，取1 mL培養(yǎng)液加入無菌蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋度為10-4、10-5、10-6的培養(yǎng)液0.1 mL，均勻涂布于LB固體平板上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)。待平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑選不同形態(tài)的菌落轉(zhuǎn)接至斜面保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃粉蟲取食PVC塑料膜情況

以PVC塑料膜為唯一食物喂食黃粉蟲的過程中，黃粉蟲能從塑料膜邊緣對(duì)塑料膜進(jìn)行取食，黃粉蟲取食塑料膜后生長(zhǎng)良好，且有部分黃粉蟲化蛹。如圖1所示，12 d后，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，PVC塑料膜邊緣有明顯被嚙噬的痕跡，薄膜面積減少明顯（圖1a），質(zhì)量逐漸降低（圖1b）；蟲體質(zhì)量也逐漸降低（圖1c）。如表1所示，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組12 d塑料膜分別減重71.7%、28.8%、42.1%，蟲體分別減重10.7%、33.9%、27.3%，塑料膜降解速率分別為0.667 mg/(d·g蟲體 )、0.303 mg/(d·g蟲體 )、0.504 mg/(d·g蟲體 )；因此，塑料嚙食率越高，蟲體重量減少越小，這可能是因?yàn)橄x體通過嚙食塑料可以在一定程度上補(bǔ)充生長(zhǎng)所需的能量。

圖1 黃粉蟲嚙食塑料膜過程中PVC質(zhì)量及蟲體質(zhì)量變化情況

表1 塑料膜減重比例與黃粉蟲生長(zhǎng)情況

在實(shí)驗(yàn)中觀察到，嚙食塑料膜較多的1號(hào)實(shí)驗(yàn)組化蛹率較高，可能是因?yàn)辄S粉蟲在即將化蛹前需取食更多的食物，以為化蛹做好能量?jī)?chǔ)備。在飼養(yǎng)過程中，黃粉蟲有相互嚙食的情況，黃粉蟲單頭重量有所升高，但去除死亡的黃粉蟲后，其總體質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這說明，黃粉蟲雖然能取食PVC塑料，但PVC塑料不能提供黃粉蟲生長(zhǎng)發(fā)育所需的全部營(yíng)養(yǎng)。

如圖2所示，以PVC塑料膜為唯一食物的黃粉蟲糞便在外觀上與以麥麩為食物的黃粉蟲的糞便明顯不同，前者糞便顏色偏暗，呈棕黑色，后者糞便顏色偏亮，呈棕黃色，說明黃粉蟲能對(duì)取食的塑料由腸道微生物進(jìn)行降解消化，但降解的產(chǎn)物與正常取食麥麩后的降解產(chǎn)物不同。

圖2 取食PVC塑料與取食麥麩的黃粉蟲糞便對(duì)比

2.2 腸道細(xì)菌的分離及鑒定

如圖3所示，培養(yǎng)前9 d左右，由于培養(yǎng)基中含有少量LB培養(yǎng)基，因此混合菌利用少量的LB培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行繁殖，菌體濃度有所增加，第9 d菌體濃度達(dá)到階段性高峰；從第9 d開始，由于少量的LB培養(yǎng)基消耗殆盡，混合菌種還未完全適應(yīng)以PVC膜為唯一碳源的生長(zhǎng)條件，菌體濃度開始下降，第15 d時(shí)，菌體濃度降至最低；從15 d開始，混合菌種開始適應(yīng)PVC膜為唯一碳源的生長(zhǎng)條件，菌體濃度開始緩慢上升；第39 d時(shí)，菌種完全適應(yīng)PVC膜為唯一碳源的生長(zhǎng)條件，開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第45 d菌體濃度達(dá)到最高值；之后，隨著無機(jī)鹽培養(yǎng)基逐漸消耗，菌種生長(zhǎng)條件開始惡化，菌體進(jìn)入衰亡期，菌體濃度開始下降。培養(yǎng)51 d后，PVC塑料膜重量從4 930 mg減少到4 782 mg，降解效率達(dá)到2.9 mg/d，失重率為3%。

圖3 以PVC塑料膜為唯一碳源的無機(jī)培養(yǎng)基中菌體濃度變化

如圖4所示，培養(yǎng)51 d后的菌體稀釋10-5后在平板上長(zhǎng)出2種共22個(gè)單菌落，可以計(jì)算出原無機(jī)培養(yǎng)基中菌體濃度為2.2×107個(gè)/mL。分離出的兩種單菌落一種表面光滑、乳白色、不透明、邊緣平整、質(zhì)地濕潤(rùn)，命名為JXXDPVC-1；另一種表面光滑、乳白色、邊緣葉狀、質(zhì)地濕潤(rùn)，命名為JXXDPVC-2。

圖4 10-5稀釋度平板生長(zhǎng)出的單菌落

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，12 d連續(xù)喂食PVC塑料膜，黃粉蟲能正常存活，部分幼蟲完成變態(tài)發(fā)育，PVC塑料膜最大減重71.7%，降解速率達(dá)到0.667 mg/(d·g蟲體)。黃粉蟲幼蟲腸道中富集了能降解PVC塑料膜的菌種，在有氧條件下從其腸道中分離篩選出能降解PVC塑料膜的2株菌種JXXDPVC-1和JXXDPVC-2，其對(duì)PVC塑料膜的降解效率達(dá)到2.9 mg/d。本研究只在有氧條件下對(duì)黃粉蟲腸道內(nèi)微生物進(jìn)行分離，在厭氧條件下是否也有微生物參與PVC塑料膜的降解還需進(jìn)一步研究。此外，對(duì)于分離出來的微生物其單菌種降解PVC塑料的能力尚未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如何能通過優(yōu)化降解條件使PVC塑料膜的降解速率最大化還有待進(jìn)一步研究。