朱俊豪，賈紅倩，張彩梅，顏軍，何鋼*

（1.成都大學(xué) 藥學(xué)院 四川抗菌素工業(yè)研究所 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610106；2.北京天衡軍威醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 102600）

黃蜀葵[Abelmoschus manihot (L.)]是一種廣泛分布于印度和中國南方多省的一年或多年生粗壯直立植物，別名黃秋葵、棉花葵、野芙蓉、雞爪蓮，為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵的干燥花冠[1]。目前，黃蜀葵相關(guān)研究的著重點(diǎn)主要在種子和果實(shí)，而花瓣作為一種傳統(tǒng)的中藥材卻研究較少[2-3]。近年來，黃蜀葵花因具有清熱解毒、消腫活血等諸多功效而逐漸進(jìn)入廣大研究人員視野被廣泛研究[4-7]。黃酮類化合物是黃蜀葵花冠中的主要活性物質(zhì)之一，具有防治心腦血管疾病、抗菌、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫等功效，而目前研究主要集中在探索總黃酮的提取工藝及其生物活性上，還鮮有黃酮成分研究的報(bào)道[8-11]。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC同時(shí)測(cè)定黃蜀葵花中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素3種黃酮成分的分析方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究和相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黃蜀葵花冠，購于成都市荷花池藥材市場(chǎng)。

1.2 試劑與儀器

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-200707），中國藥品生物制品檢定所；金絲桃苷對(duì)照品，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)100081-200406），中國藥品與生物制品檢定所；乙腈，色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；磷酸、甲醇，分析純，成都市科龍化工試劑廠；水為超純水。

1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；FA2004B型電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；YB-1000A型粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液配制

分別精密稱取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對(duì)照品0.10 mg、0.63 mg、0.23 mg，置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，超聲助溶，配成濃度分別為0.010 mg/mL、0.063 mg/mL、0.023 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

1.3.2 供試品制備

取黃蜀葵花冠粉碎，過80目篩。稱取黃蜀葵花冠粉約1.5 g，置50 mL容量瓶中，加入60%甲醇溶液50 mL，超聲（功率70 W）提取10 min，室溫放冷后，補(bǔ)充60%甲醇定容，振蕩均勻，0.45 μm的濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3.3 樣品含量測(cè)定

精密稱取黃蜀葵花粉末1.5 g，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，稀釋10倍進(jìn)樣，記錄蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算含量。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters Brownlee SPP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng) 256 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.7 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2%磷酸溶液，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）線性關(guān)系考察：將“1.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用60%甲醇逐級(jí)稀釋成系列濃度的溶液，分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

（2）精密度考察：精密吸取（1）項(xiàng)下中間濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄每個(gè)對(duì)照品的峰面積，求得RSD值。

（3）穩(wěn)定性考察：取同一供試品溶液，按照“1.3.4”項(xiàng)下的色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h進(jìn)樣，記錄3種成分的峰面積，測(cè)得蘆丁、金絲桃苷、槲皮素峰面積的RSD值。

（4）重復(fù)性考察：按照“1.3.2”項(xiàng)下的條件，平行配制供試品溶液6份，按照“1.3.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)得樣品中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的RSD值。

（5）加樣回收考察：精密稱取“1.3.2”項(xiàng)下處理的已知含量的金花葵粉末6份，每份約1.5 g，精密稱定，60%甲醇定容至50 mL容量瓶中，分別精密加入一定量的蘆?。?.60 μg）、金絲桃苷（35.00 μg）、槲皮素（15.00 μg）對(duì)照品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下的條件制備供試品溶液，稀釋2倍進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算3種成分的RSD值和平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖分析

如圖1所示，混合標(biāo)準(zhǔn)品出峰順序?yàn)樘J丁、金絲桃苷和槲皮素，圖2中供試品各成分出峰位置與之對(duì)應(yīng)。在“1.3.4”色譜條件下，蘆丁、金絲桃苷和槲皮素分離效果良好，分離度均＞3.5，且理論塔板數(shù)均不低于200 00。

圖1 混合對(duì)照品的高效液相色譜圖

圖2 供試品的高效液相圖譜

2.2 樣品含量測(cè)定

黃蜀葵花冠供試品中，蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量分別為0.39 mg/L、3.21 mg/L、0.87 mg/L，金絲桃苷含量最高。

2.3 方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系

對(duì)蘆丁、金絲桃苷和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍進(jìn)行考察，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍如表2所示，線性和范圍結(jié)果均良好。

表2 各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 精密度考察

取“1.3.1”項(xiàng)下中間濃度的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每個(gè)對(duì)照品的峰面積，求得RSD值。蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的RSD值分別是0.45%、0.12%和0.60%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄3種成分的峰面積，通過計(jì)算得蘆丁、金絲桃苷、槲皮素峰面積的RSD值分別為1.63%、1.12%、1.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性考察

相同操作平行配制供試品溶液6份，按照“1.3.4”的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得到樣品中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的RSD值分別為0.38%、0.35%、0.71%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收考察

精密稱取同一批已知含量的黃蜀葵花冠粉末6份，每份約1.5 g，精密稱定，60%甲醇定容至50 mL容量瓶中，分別精密加入一定量的蘆丁、金絲桃苷、槲皮素對(duì)照品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下的條件制備供試品溶液，稀釋2倍進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算3種成分的RSD值和平均回收率如表3所示。3個(gè)RSD值均較小，說明此測(cè)定方法穩(wěn)定且可行性高。

表3 金花葵全花粉末加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

利用高效液相色譜儀同時(shí)測(cè)定黃蜀葵花冠中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量，該方法簡(jiǎn)便快速，干擾小，線性范圍寬，重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和回收率良好，科學(xué)合理，適用于黃蜀葵花冠中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的同時(shí)檢測(cè)。