尹文娟，劉 芳，孟凡娟，張廣成，王麗燕，孫金生

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國重要的對蝦養(yǎng)殖品種，近年來受對蝦病害頻繁發(fā)生的影響，對蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了重大經(jīng)濟損失，尤以病毒性疾病發(fā)生最為嚴重[1].其中，白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病毒性病原之一.多項研究表明，自噬在病毒侵染增殖中具有重要作用[2-4]. 自噬作為一種溶酶體降解途徑，是實現(xiàn)細胞內(nèi)物質(zhì)與能量平衡的一個重要的細胞學(xué)過程.在酵母中已鑒定出超過36 種自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG），其中大部分在哺乳動物中存在相應(yīng)的同源基因[5-6].自噬相關(guān)基因參與到調(diào)控自噬機制的整個過程當(dāng)中，包括自噬泡的形成、自噬體膜的延伸、自噬小體與溶酶體融合以及自噬溶酶體的降解等[6-8].自噬的發(fā)生主要是依靠2 個泛素樣蛋白系統(tǒng)和Ⅲ型磷脂酰肌醇3 磷酸激酶.ATG3 蛋白是自噬發(fā)生過程中的一種類泛素化E2 蛋白，在LC3 蛋白的脂化系統(tǒng)中起重要作用[9].ATG3 在自噬調(diào)節(jié)中作為關(guān)鍵基因扮演多重角色，其一是信號通路激活的關(guān)鍵蛋白，其二是自噬小體形成的關(guān)鍵調(diào)控基因[10].節(jié)肢動物中，果蠅Aut1是ATG3 的同源基因，RNA 干擾Aut1 基因后，果蠅的自噬水平下調(diào)[11]；葉濱[12]通過RNA 干擾家蠶ATG3 和ATG8 基因或利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除ATG3 和ATG8 基因后，發(fā)現(xiàn)家蠶的細胞自噬水平降低，而超表達ATG3 和ATG8 基因后細胞的自噬水平升高，說明ATG3 在節(jié)肢動物細胞自噬過程中發(fā)揮了重要作用.

本研究根據(jù)凡納濱對蝦的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計引物，以凡納濱對蝦血細胞為模板進行PCR 擴增，克隆獲得了凡納濱對蝦自噬相關(guān)基因ATG3 的序列（LvATG3），對其進行生物信息學(xué)分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.進一步對LvATG3 基因的組織分布特性進行研究，并利用熒光定量PCR 技術(shù)檢測凡納濱對蝦的自噬相關(guān)蛋白ATG3 在病毒感染后的表達變化，以此了解該基因在對蝦先天免疫過程中的作用，同時也為其他自噬相關(guān)基因的研究提供實驗基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

凡納濱對蝦：天津市水產(chǎn)研究所增殖站，體質(zhì)量為（5.6±3.5）g，體長為（10.1±1.3）cm.實驗前放在循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)3 d，養(yǎng)殖溫度為25 ℃，每天喂食2次.

WSSV 病毒懸液：參照文獻[13]中的方法制備.

1.1.2 試劑

TRIzolTMReagent，美國Invitrogen 公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Promega 公司；質(zhì)粒提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒，上海生工生物公司；pMD18-T載體連接試劑盒，大連寶生物公司；DNA Marker，北京博邁德基因技術(shù)有限公司；DH5α 感受態(tài)細胞，北京天根生物公司.本實驗中引物序列由華大基因公司合成，序列信息如表1 所示.

1.1.3 儀器

PCR 儀，美國ABI 公司；GelDocTMXR 成像系統(tǒng)、電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Nano Drop 2000 超微量分光光度計，美國Thermo Scientific 公司.

表1 實驗所用引物序列信息Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 凡納濱對蝦組織樣品制備

選取7 只健康有活力的凡納濱對蝦，分別取眼柄、鰓、心臟、肝胰臟、肌肉、胃、中腸、后腸、表皮、神經(jīng)、血細胞共11 種組織，保存于液氮中.

選取35 只健康凡納濱對蝦，分別注射10 μL 病毒懸液[13].另取35 只凡納濱對蝦，注射10 μL TN buffer（0.24 g Tris-HCl，22.34 g NaCl，pH 值為7.4）作為對照組.25 ℃條件下分開養(yǎng)殖感染組和對照組對蝦，分別在注射后的6、12、24、36、48、60、72 h，各取5 只對蝦的血淋巴，離心獲取血細胞后凍存于液氮中.

1.2.2 凡納濱對蝦總RNA 提取及cDNA 合成

利用TRIzol 法分別提取凡納濱對蝦11 種組織及注射感染不同時間的血細胞總RNA.取1 μL RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Nano Drop 2000 超微量分光光度計分別測其OD 值.各樣品分別取1 μg 作為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以AOLP 和BDA 為接頭引物合成cDNA，使用隨機引物合成cDNA 用于熒光定量PCR 檢測.

1.2.3 LvATG3 基因克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列，設(shè)計凡納濱對蝦自噬相關(guān)基因ATG3 的全長特異性引物L(fēng)vATG3-F 和LvATG3-R，以1.2.2 節(jié)中合成的cDNA 為模板進行PCR 反應(yīng).25 μL 的反應(yīng)體系中包含無酶水4.25 μL、LvATG3-F 引物0.5 μL、LvATG3-R 引物0.5 μL、2×Taq PCR Master Mix 6.25 μL、cDNA 1 μL.反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃冷卻.產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行檢測，切膠回收后與pMD18-T 載體進行4 ℃連接，轉(zhuǎn)化DH5α 后挑取單菌落，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序.

1.2.4 LvATG3 基因序列的生物信息學(xué)分析

在http：//web.expasy.org/compute_pi 上預(yù)測LvATG基因的等電點和分子質(zhì)量；應(yīng)用NCBI 的CDD 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分 析基因編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)域特征. 應(yīng)用在線翻譯軟件（http：//web.expasy.org/translate/）對測序結(jié)果進行氨基酸翻譯；應(yīng)用Clustal W 與MEGA 5.0.1 對不同物種的ATG3 蛋白進行比對和分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

1.2.5 LvATG3 的組織表達分析

將1.2.1 中獲取的11 種對蝦組織的cDNA 稀釋10 倍后用作模板，利用熒光定量PCR 技術(shù)檢測LvATG3 在各組織中的表達. 根據(jù)內(nèi)參基因18S 設(shè)計引物18S-F 和18S-R（表1），目的基因引物為LvATG3-semi-F 和LvATG3-semi-R（表1）.在25 μL 反應(yīng)體系中包含10 μL SYBR、0.4 μL LvATG3-semi-F 或18S-F、0.4 μL LvATG3-semi-R 或18S-R、7.2 μL 滅菌水和2 μL 模板.熒光定量PCR 反應(yīng)條件為95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃35 s，40 個循環(huán).反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出結(jié)果，應(yīng)用2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt 樣品-ΔCt 對照）算法對所得數(shù)據(jù)進行計算，分析LvATG3 的相對表達量，應(yīng)用SPSS 檢測t 檢驗分析差異的統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）.

1.2.6 WSSV 侵染后血細胞LvATG3 的表達分析

將1.2.1 中WSSV 病毒感染后不同時間點的血細胞cDNA 稀釋10 倍后用作模板，利用熒光定量PCR檢測LvATG3 對WSSV 的免疫應(yīng)答反應(yīng). 熒光定量PCR 檢測及分析方法同1.2.5.

2 結(jié)果與分析

2.1 LvATG3 基因克隆及序列分析

本研究利用PCR 技術(shù)克隆獲得了LvATG3 的cDNA 全長，共948 bp，編碼315 個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為35.527×103，等電點為4.58，含有3 個自噬相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，分別是N 末端結(jié)構(gòu)域、活化位點結(jié)構(gòu)域和C末端結(jié)構(gòu)域，如圖1 所示.多序列比對如圖2所示，LvATG3 編碼的蛋白與節(jié)肢動物門其他物種的自噬相關(guān)蛋白具有很高的序列相似性，其中，與側(cè)溝繭蜂（Microplitisdemolitor）、阿根廷螞蟻（Linepithema humile）ATG3 基因編碼的自噬相關(guān)蛋白的序列相似性達到71%.利用MEGA 5.0.1 軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖3 所示，凡納濱對蝦的自噬相關(guān)蛋白與黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的自噬相關(guān)蛋白聚為一支.

2.2 LvATG3 的組織表達特征

利用熒光定量PCR 的方法檢測了LvATG3 在凡納濱對蝦11 種組織中的表達情況，并且通過Origin 8.0軟件對定量結(jié)果進行分析，結(jié)果如圖4 所示.由圖4 可以看出，LvATG3 基因在凡納濱對蝦的11 種組織中均有表達，其中在中腸、后腸、鰓和血細胞中的表達量較高，其次是在胃和肝胰腺中，在眼柄中的表達量最低.

圖1 凡納濱對蝦LvATG3 基因全長及編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of LvATG3 gene in Litopenaeus vannamei

圖2 凡納濱對蝦與其他物種自噬相關(guān)蛋白的氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence comparison of ATG3 proteins between Litopenaeus vannamei and other species

圖3 凡納濱對蝦LvATG3 與其他物種自噬相關(guān)蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the sequences of ATG3 proteins in Litopenaeus vannamei with other species

2.3 WSSV 侵染后LvATG3 的表達特征

凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV 后不同時間在血淋巴細胞中的LvATG3 表達情況如圖5 所示.由圖5 可以看出，對照組中，隨著培養(yǎng)時間的延長，LvATG3 的表達量基本穩(wěn)定；實驗組中，培養(yǎng)初期LvATG3 的表達量下降，顯著低于對照組（P ＜0.05），中后期LvATG3 的表達量上升，在病毒感染后24～60 h，LvATG3 的表達量與對照組無顯著差異（P ＜0.05）；病毒感染后72 h，LvATG3 的表達量顯著高于對照組（P ＜0.05）.

圖4 凡納濱對蝦LvATG3 基因在各組織中的表達情況Fig.4 Expression of LvATG3 in different tissues of Litopenaeus vannamei

圖5 WSSV 感染不同時間后LvATG3 基因的表達Fig.5 Relative expression of LvATG3 during WSSV infection

3 討論與結(jié)論

自噬是存在于真核生物中的一個高度保守的過程，細胞內(nèi)衰老的蛋白質(zhì)或多余的細胞器均可通過自噬過程被降解，以維持機體自身的穩(wěn)定狀態(tài)，在病原感染方面發(fā)揮的作用也越來越被重視[14].目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多自噬相關(guān)基因可通過影響自噬體的形成發(fā)揮調(diào)控作用，如ATG3、ATG7、ATG8、Beclin1 等[15-16].本研究成功獲得了凡納濱對蝦自噬相關(guān)基因LvATG3 的cDNA 全長，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，LvATG3 編碼的蛋白與節(jié)肢動物門其他物種的自噬相關(guān)蛋白具有很高的序列相似性，其中與側(cè)溝繭蜂、阿根廷螞蟻ATG3 基因編碼的自噬相關(guān)蛋白序列相似性達到71%，表明LvATG3 與已報道的其他物種的ATG3 蛋白在氨基酸組成和潛在功能上無較大差異，是一種在各物種中比較保守的自噬相關(guān)蛋白，可以參與免疫過程.

LvATG3 組織表達研究顯示，LvATG3 在檢測的11 種對蝦組織中均有表達，表明自噬是一種在對蝦機體細胞中廣泛存在的現(xiàn)象，不具有組織特異性，但其表達量在不同組織中有差異，在腸道、鰓和血細胞中表達量明顯高于其他組織.Wu 等[17]指出，腸道是對蝦消化系統(tǒng)的重要器官，連通外部環(huán)境，對于環(huán)境中致病菌的識別和清除有重要作用，也是白斑綜合癥病毒（WSSV）入侵的首要靶器官，血細胞在對蝦的免疫防御中也發(fā)揮了重要作用.在病原入侵的過程中，血細胞及其釋放的免疫因子通過吞噬、包囊和結(jié)節(jié)等作用消除病原，維持機體健康[17].本研究中凡納濱對蝦LvATG3 在這些組織中的高表達也表明其在機體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了一定作用.

為進一步揭示自噬相關(guān)蛋白LvATG3 及自噬在WSSV 感染中的作用，本研究檢測了WSSV 感染后不同時間凡納濱對蝦LvATG3 基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)LvATG3 在病毒感染不同時間表達差異顯著，感染初期表達下降，顯著低于對照組，后期表達量上升，培養(yǎng)60 h 后超過對照組.推測病毒侵染調(diào)控或影響了自噬相關(guān)基因LvATG3 及其參與的細胞自噬.Sun 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，病毒增殖可以利用細胞自噬：病毒侵染初期，細胞為避免病毒對其自身的利用，會相對下調(diào)自噬相關(guān)基因的表達，從而降低自噬水平；病毒侵染后期，病毒大量增殖，會反過來調(diào)控自噬過程，使自噬水平上調(diào)，自噬相關(guān)基因表達量上升.本研究結(jié)果與Sun 等的結(jié)論一致.