王永輝，王 靜，金 欣，郭美琪，覃東玉，劉新宇，李 敏，潘麗娜

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；3.天津師范大學天津動物多樣性保護與利用重點實驗室，天津300387；4.漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心，河南漯河462300）

昆蟲嗅覺系統(tǒng)通常由氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、化學感受蛋白（chemosensory proteins，CSPs）、神經(jīng)元膜蛋白（sensory neuron membrane proteins，SNMPs）、氣味受體（olfactory receptors，ORs）及氣味降解酶（odor degrading enzymes，ODEs）等構成[1-2].氣味分子進入感器淋巴液與其中的氣味結合蛋白相結合，能夠使嗅覺神經(jīng)元膜上的氣味受體被激活，產(chǎn)生動作電位，從而引起一系列相關的行為響應[3-4].氣味結合蛋白能夠與氣味分子特異性結合，起到初步過濾氣味分子的作用，是昆蟲嗅覺識別過程中的關鍵環(huán)節(jié).近年來，OBPs 與氣味分子的結合機制受到廣泛關注.如Zhang 等[5]、Li 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，膜翅目昆蟲中紅側溝繭蜂（Microplitis mediator）的5 種OBP 對不同的氣味分子結合力不同，其中MmedOBP 的最佳配體是β-紫羅蘭酮；Li 等[7]研究東方蜜蜂（Apis cerana Fabricius）的氣味結合蛋白，發(fā)現(xiàn)AcerOBP2 與花卉揮發(fā)物和蜜蜂信息素結合緊密；Wang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，雄性傳粉榕小蜂（Ficus auriculata）可能利用CsolOBP1 和CsolOBP2 通過與信息素結合來尋找雌性完成交配；Wang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鞘翅目昆蟲白蠟窄吉?。ˋgrilus planipennis Fairmaire）的AplaOBP1 可與9 種植物揮發(fā)物高度結合，其中包含寄主樹的5 種萜烯類化合物.

白蛾周氏嚙小蜂（Chouioia cunea Yang）是世界性檢疫害蟲——美國白蛾（Hypanthia cunea Drury）蛹期的重要寄生性天敵，在美國白蛾的生物防治方面具有廣闊前景[10-12].白蛾周氏嚙小蜂主要依賴嗅覺系統(tǒng)識別并定位寄主，本課題組早期轉錄組測序發(fā)現(xiàn)了25 個白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBPs、11 個化學感受蛋白CcCSPs、1 個神經(jīng)元膜蛋白CcSNMP、80 個氣味受體CcORs、31 個味覺受體CcGRs 和10 個離子受體CcIRs[13-14]. 此外，本課題組對美國白蛾蛹、舞毒蛾蛹、白蠟、臭椿、泡桐以及常見植物的揮發(fā)物進行GCMS 分析，篩選得到了50 余種小分子化合物[15].

為進一步探究白蛾周氏嚙小蜂雌雄個體共有的嗅覺反應機制，本研究選取在白蛾周氏嚙小蜂雌雄觸角均大量表達的一個氣味結合蛋白CcOBP5，通過分子對接技術篩選出可與之特異性結合的氣味分子.采用RT-PCR 技術克隆CcOBP5 的全長cDNA 序列，構建原核表達質粒，并誘導重組蛋白大量表達，通過熒光結合實驗對分子對接篩選得到的小分子化合物的結合能力進行測定，為進一步完整揭示白蛾周氏嚙小蜂的嗅覺機制積累研究數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲飼養(yǎng)和組織收集

白蛾周氏嚙小蜂由河南省漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心惠贈，接入柞蠶（Antheraea pernyi）蛹后，在本實驗室內于25 ℃、相對濕度70%的條件下擴繁. 選取在第一天孵化的雌性白蛾周氏嚙小蜂，將其浸入RNA Later（美國Ambion 公司），收集于1.5 mL 離心管中.收集的所有材料均保存于-20 ℃條件下.

1.2 三維結構建模和分子對接

CcOBP5 堿基序列由本課題組前期采用轉錄組測序技術對雌雄白蛾周氏嚙小蜂的觸角進行測序獲得[7]，使用Swiss-Mode（http：//swissmodel.expasy.org/）進行同源性建模[16]，獲得蛋白的三維結構.隨后，通過Ramachandran 圖和Verify-3D 評估三維模型的質量[17-18].

從Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載小分子物質的三維結構用以進行分子對接的準備.首先將CcOBP5 的三維結構導入至Schrodinger Suites 2015-2 中的Maestro10.2 軟件，手動輸入蛋白三維結構具體坐標并進行調整，使蛋白的活性中心盡可能位于盒子的中心位置，生成文件后保存.然后分別將小分子物質的結構導入，對小分子物質的其他構象進行搜索，生成文件后保存.最后使用Maestro10.2 進行分子對接.

1.3 RNA 提取和克隆

使用Trizol 試劑提取總RNA. 使用TransScript RT試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）合成第一鏈cDNA.根據(jù)CcOBP5 的cDNA 序列，設計了正向和反向引物用于CcOBP5 片段擴增，應用BamHI/HindⅢ雙酶切后，與pET-28a 載體連接構建CcOBP5-pET28a 重組質粒，并由蘇州金唯智生物科技有限公司測序正確.

1.4 重組蛋白的表達與純化

將CcOBP5-pET28a 重組質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中進行蛋白表達，37 ℃下用濃度0.1 mmol/L 的IPTG 誘導5 h.之后在8 000 r/min 下離心2 min，小心收集大腸桿菌沉淀，并將其重懸于裂解緩沖液（含有50 mmol/L 的NaH2PO4、300 mmol/L 的NaCl、10 mmol/L 的咪唑和1 mg/mL 的溶菌酶）中.用超聲技術處理重懸的溶液，然后在12 000 r/min 下離心30 min.由于在大腸桿菌中表達的蛋白質以包涵體形式存在，為了獲得可溶蛋白，首先按照變性方案用Ni-NTA-瓊脂糖純化包涵體，然后通過逐漸降低其濃度使其復性，最后使用質量分數(shù)為18%的SDS-PAGE 凝膠驗證純化的蛋白質.

1.5 競爭性熒光結合實驗

選擇1-N-苯基-萘胺（1-NPN）作為熒光探針并在甲醇中稀釋，使?jié)舛冗_到1 mmol/L.在50 mmol/L Tris-HCl（pH 值為7.4）中稀釋至2 μmol/L 后，將獲得的蛋白質與0～40 μmol/L 范圍內不同濃度的1-NPN 混合，測量蛋白質的結合常數(shù).激發(fā)波長設置為337 nm，發(fā)射光譜在380～500 nm 之間，通過Infinite 200 Pro 多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）完成此測定. 將1-NPN、2 μmol/L 獲得的蛋白質和不同濃度的γ-丁內酯（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L）混合以測量激發(fā)后的熒光變化，計算特定蛋白質與被測化合物之間的結合親和力.從3 個獨立的測量中收集結合數(shù)據(jù).結合化學物質的飽和化學計量比為1 ∶1（蛋白質∶配體）.該評估基于熒光強度并假設蛋白質為100%活性.通過斯卡查德圖對結合曲線進行線性化.使用Prism 5 分析IC50和解離常數(shù)（Kd）.抑制常數(shù)（Ki）用以下公式進行計算

式中：C1-NPN為1-NPN 的游離濃度.

1.6 行為學分析

在Y 型嗅覺儀器上測量雌性白蛾周氏嚙小蜂對配體的行為響應，該儀器由中央管玻璃（直徑22 mm，長115 mm）和2 個側臂（直徑22 mm，長75 mm）組成.從氣泵中通入空氣（200 mL/min），將每只1 日齡的成年小峰放置在Y 型管中央臂的底部30 s，同時觀察它們對化合物的反應.在5 min 內沒有行為反應的昆蟲被排除在進一步分析之外.進入含有化合物氣味源的側臂并停留至少10 s 的受試者被確定為具有趨向性，而進入無氣味的側臂的受試者被確定為趨避性.每只小蜂測試1 次，每觀察10 只，將Y 型管對調方向，以消除位置誤差，每個氣味標樣測試50 只小蜂，測試完畢用無水酒精清潔試管并風干.

2 結果與分析

2.1 CcOBP5 同源建模及分子對接

本課題組早期通過對白蛾周氏嚙小蜂觸角轉錄組測序獲得25 種OBP 蛋白序列，其中CcOBP5 的開放閱讀框為408 bp，編碼136 個氨基酸，相對分子質量為15.21×103，在雌雄觸角中均廣泛表達.為進一步研究CcOBP5 在白蛾周氏嚙小蜂嗅覺識別中的作用，根據(jù)已經(jīng)得到的白蛾周氏嚙小蜂CcOBP5 全序列，在Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）上對CcOBP5進行同源建模，結果如圖1 所示.

圖1 白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP5 的三維結構Fig.1 3D structure of odorant binding protein CcOBP5 of C.cunea

白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP5 的三維結構有6 個α 螺旋，分別為Glu29-Glu41（α1）、Lys46-Val53（α2）、Cys66-Ser74（α3）、Gly86-Tyr92（α4）、Val98-Cys108（α5）、Cys118-Asp134（α6），與紅蠅（Phormia regina）的氣味結合蛋白OBP56a（PDB-ID：5dic）的相似度最高.這2 個蛋白的一級結構差異較大，但二級結構尤其是關鍵的α 螺旋區(qū)氨基酸保守性較高，相似度為34%.通常情況下，模型的相似度在30%以上便可獲得相對合理的構象[19].

為進一步評估模型的合理性，利用PROSA（https：//prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php）對同源建模所得的蛋白質結構模型進行能量評價，結果如圖2 所示.置信度GMQE 值（0～1 之間為合理）為0.56，匹配度QMEAN 值（-4～0 之間為合理）為-1.75.拉氏構象（Ramachandran）分析結果如圖3（a）所示.由圖3（a）可以看出，91.7%的CcOBP5 氨基酸殘基落在最佳區(qū)域（藍色區(qū)域），6.5%的氨基酸殘基落在較合理區(qū)域（紫色區(qū)域），沒有氨基酸殘基落在不允許區(qū)域（白色）.verify-3D 結果如圖3（b）所示，89.81%氨基酸殘基的3D-1D 值≥0.2，通常該模型中80%以上氨基酸殘基的3D-1D 值≥0.2 即可認定模型合理.以上結果表明，此CcOBP5 的預測模型是可靠且合理的，可用于后續(xù)的分子對接實驗.

圖2 CcOBP5 蛋白整體模型質量Fig.2 Overall quality of CcOBP5 model

圖3 CcOBP5 三維模型的拉氏構象及verify-3D 模型評估Fig.3 Rational evaluation of the established 3D model of CcOBP5 by Ramachandran plot and verify-3D

應用本課題組發(fā)現(xiàn)的美國白蛾蛹、舞毒蛾蛹共有揮發(fā)物以及美國白蛾咬食后白蠟、臭椿、泡桐的揮發(fā)物共52 種小分子物質與CcOBP5 進行分子對接，結果如表1 所示.由表1 可以看出，多種揮發(fā)性氣味分子可能與CcOBP5 特異性結合，其中，CcOBP5 與γ-丁內酯的結合性最佳. 選取γ-丁內酯作圖，結果如圖4 所示. 由圖4 可以看出，CcOBP5 通過Cys-38、Ile-39 和Lys-37 與γ-丁內酯形成保守氫鍵.

2.2 CcOBP5 基因克隆與表達

為進一步檢測上述分子對接結果，以白蛾周氏嚙小蜂cDNA 為模板，應用CcOBP5 基因特異性引物PCR 獲得該基因片段，采用BamHI/HindIII 雙酶切，構建CcOBP5-pET-28a 重組質粒，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達和純化，結果如圖5 所示.由圖5 可以看出，IPTG 可明顯誘導CcOBP5 蛋白表達（第2 泳道），而pET-28a 空質粒轉化菌無相應蛋白表達（第1 泳道），應用Ni-NTA agarose 試劑盒可獲得高純度CcOBP5 蛋白（第3 泳道），該蛋白可用于熒光結合實驗分析.

2.3 熒光結合實驗檢測CcOBP5 與揮發(fā)性化合物的結合

測定1-NPN 熒光探針與CcOBP5 結合的親和力，結果如圖6 所示，計算可得CcOBP5 的解離常數(shù)為23.44 μmol/L. 分子對接實驗結果顯示γ-丁內酯與CcOBP5 結合最佳，且早期研究發(fā)現(xiàn)γ-丁內酯是一種美國白蛾蛹揮發(fā)物[15]. 為進一步驗證分子對接實驗結果，通過熒光競爭結合實驗發(fā)現(xiàn)γ-丁內酯可與CcOBP5 特異性結合，其IC50為34.72 μmol/L，抑制常數(shù)為31.99 μmol/L.

圖4 分子對接顯示CcOBP5 與γ-丁內酯結合Fig.4 Docking results of CcOBP5 with γ-Butyrolactone

圖5 重組CcOBP5 的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant CcOBP5

圖6 重組CcOBP5 的1-NPN 及其與γ-丁內酯的結合曲線Fig.6 Binding curves of 1-NPN and γ-butyrolactone for the recombinant CcOBP5

2.4 白蛾周氏嚙小蜂對γ-丁內酯的行為學反應

為了進一步研究γ-丁內酯與CcOBP5 結合的的生物學功能，以石蠟油為對照組，使用Y 型嗅覺儀測定白蛾周氏嚙小蜂對不同濃度（0.05～100.00 mmol/L）γ-丁內酯的行為學反應，結果如圖7 所示.由圖7 可以看出，白蛾周氏嚙小蜂對γ-丁內酯的選擇率隨濃度升高而增加，γ-丁內酯對白蛾周氏嚙小蜂的趨避作用也隨著濃度升高而增強.

圖7 Y 型嗅覺儀檢測白蛾周氏嚙小蜂對γ-丁內酯的行為學反應Fig.7 Behavioral response of female individuals to γ-butyrolactone investigated in Y-tube olfactometer

3 討論與結論

CcOBP5 為本課題組早期通過轉錄組測序獲得的一種在白蛾周氏嚙小蜂觸角中大量表達的氣味結合蛋白，經(jīng)Bio Edit 和HMMTop 軟件分析發(fā)現(xiàn)，CcOBP5具有昆蟲氣味結合蛋白的典型特征，如相對分子質量小、具有6 個典型α 螺旋和6 個保守的半胱氨酸位點（C38、C66、C70、C108、C118、C127）等.本研究通過Swiss-Model 在線搜索建模，發(fā)現(xiàn)紅蠅的氣味結合蛋白OBP56a（PDB-ID：5dic）與白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP5的相似度最高. Ramachandran 和PROSA 能量評價結果均表明模型構象合理.利用分子對接技術在美國白蛾蛹等的揮發(fā)物中初步篩選出能夠與CcOBP5 特異性結合的小分子化合物，結果表明，白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP5 與γ-丁內酯的結合最好，分子對接打分為-5.733 94.

本研究通過生物信息學和分子對接技術對白蛾周氏嚙小蜂氣味結合蛋白CcOBP5 進行了多角度的預測分析，之后通過原核表達并純化CcOBP5 蛋白.利用熒光結合實驗檢測重組CcOBP5 與γ-丁內酯的結合情況，發(fā)現(xiàn)CcOBP5 可與γ-丁內酯特異性結合，同時白蛾周氏嚙小蜂對γ-丁內酯有明顯趨避反應，推測其對γ-丁內酯的趨避反應可能與CcOBP5 相關.本研究可為CcOBP5 的后續(xù)研究和進一步探明白蛾周氏嚙小蜂的嗅覺機制奠定基礎.