張俊慶 鄭安科 高立紅 孫亞敏 姜志陽

摘要[目的]分離鑒定辣椒枯萎病主要致病菌，探尋能夠有效抑制該致病菌的生防菌株。[方法]采用植物病害組織致病菌劃線分離方法分離致病菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)以及ITS區(qū)域PCR檢測(cè)，確定菌株屬性，通過平板拮抗篩選，確定對(duì)該致病菌具有拮抗作用的農(nóng)用生防菌株。[結(jié)果]初步鑒定該致病菌為尖孢鐮刀（Fusariumoxysporum），將該致病菌與11株農(nóng)用微生物芽孢桿菌和3株農(nóng)用微生物木霉菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、海洋芽孢桿菌（Bacillusmarinus）、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillusfirmus）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）6株芽孢桿菌對(duì)該致病菌拮抗效果明顯，長(zhǎng)枝木霉（Trichodermalongibrachiatum）與哈茨木霉（Trichodermaharzianum）2株木霉菌對(duì)該致病菌具有明顯的拮抗效果。[結(jié)論]篩選到了8株能夠有效抑制該病原菌的生防菌株，為以后研究生防肥料奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞枯萎病;分離;鑒定;拮抗菌;篩選

中圖分類號(hào)S436.418.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2021）08-0134-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.035

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

IsolationandIdentificationoftheMainPathogensCausingCapsicumWiltandScreeningofAgriculturalAntagonisms

ZHANGJun-qing，ZHENGAn-ke，GAOLi-hongetal

（ShandongElephantResearchandDevelopmentCenter，Jining，Shandong272507）

Abstract[Objective]Toisolateandidentifythemainpathogenicbacteriaofpepperfusariumwilt，andtosearchforbiocontrolstrainsthatcaneffectivelyinhibitthepathogenicbacteria.[Method]Thepathogenicbacteriawereseparatedbystreakingandisolationofpathogenicbacteriafromplantdiseasetissues，andthemorphologyandPCRdetectionofITSareawereusedtodeterminetheattributesofthestrains.Throughplateantagonisticscreening，theagriculturalbiocontrolstrainswithantagonisticeffectsonthepathogenswasdetermined.[Result]ThepathogenicbacteriawaspreliminarilyidentifiedasFusariumoxysporum.Thepathogenicbacteriawasscreenedwith11strainsofagriculturalmicroorganismsBacillusand3strainsofagriculturalmicroorganismsTrichodermainantagonisticexperiments.ItwasfoundthatthesixstrainsofBacillusincludingBacillussubtilis，Bacillusthuringiensis，Bacillusamyloliquefaciens，Bacillusmarinus，Bacillusfirmus，Bacillusmethylotrophicushadobviousantagonisticeffectonthepathogenicbacteria，andtwostrainsofTrichodermaincludingTrichodermalongibrachiatumandTrichodermaharzianumhadobviousantagonisticeffectsonthepathogenicbacteria.[Conclusion]Throughthisresearch，8biocontrolstrainsthatcaneffectivelyinhibitthepathogenwerescreened，whichpavesthewayforstudyingbiocontrolfertilizers.

KeywordsFusariumwilt;Isolation;Identification;Antagonisticantibacterial;Screening

枯萎病作為一種常見的植物病害已成為制約經(jīng)濟(jì)作物發(fā)展的一大主要病害，特別是對(duì)黃瓜[1]、番茄[2]、茄子[3-4]、香蕉[5]以及款冬花[6]等造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，這些年隨產(chǎn)業(yè)化集中，辣椒等蔬菜復(fù)種指數(shù)的提高，枯萎病的發(fā)生呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了我國(guó)辣椒質(zhì)量以及農(nóng)戶的收入，辣椒枯萎病的發(fā)生率一般為15%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)70%～80%，成為辣椒的一個(gè)重要病害[7]。研究表明，辣椒枯萎病主要為鐮刀菌所致，黃立志等[8]、黃素芳等[9]、梁建根等[10]研究表明，廣西玉林、福建漳州、山西等辣椒枯萎病均由尖孢鐮刀菌所致。目前防治主要以化學(xué)手段為主，高殘留耐藥性等嚴(yán)重影響蔬菜品質(zhì)[11]，引起環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留[12]。筆者從病原菌出發(fā)，分離病原菌探索對(duì)該病原菌具有拮抗作用的有益微生物，尋找對(duì)應(yīng)的生物防治手段，從生物學(xué)角度提高辣椒品質(zhì)，減少損失。

1材料與方法

1.1材料

供試材料取自安徽省蚌埠市五河縣蔬菜基地，該基地蔬菜種類豐富，種植密度大，復(fù)耕率高，辣椒枯萎問題較為嚴(yán)重，在辣椒成株期間選取發(fā)病比較嚴(yán)重的地塊，摘取樣本。

基因組提取試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司，孟加拉紅培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司，其成分：蛋白胨5.0g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，葡萄糖10g/L，氯霉素0.1g/L，孟加拉紅0.033g/L，瓊脂20g/L;馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯（去皮）200.0g，葡萄糖20.0g，蒸餾水1000mL，煮沸后保持20min，并用4層紗布過濾殘?jiān)?，加入瓊脂?5g/L，pH自然;DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司。涉及到的芽孢桿菌枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、海洋芽孢桿菌（Bacillusmarinus）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillusfirmus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）、巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、膠凍樣芽孢桿菌（Bacillusmucilaginosus）、高地芽孢桿菌（Bacillusaltitudinis）、多黏芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）由山東土木啟生物科技有限公司研發(fā)中心保存，生防真菌（綠色木霉（Trichodermaviride）、哈茨木霉（Trichodermaharzianum）、長(zhǎng)枝木霉（Trichodermalongibrachiatum）由沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所提供。

1.2病原菌的分離純化

選取發(fā)病植株的病根、莖部作為分離標(biāo)本，分別用無菌水沖洗干凈，并將組織切小塊，在70%乙醇中浸泡30s，然后放入0.1%的升汞中浸泡5min，撈出后用無菌水沖洗10次以上，在無菌條件下接種于PDA平板上，接種時(shí)使得維管束一面與培養(yǎng)基正面接觸，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d，將長(zhǎng)出菌落切取邊緣部分重新接種到新的孟加拉紅平板上培養(yǎng)，直到分離出單一形態(tài)的菌種，并將不同組織的分離菌落分別保存于4℃冰箱待用[6]。

將分離到的病原菌接種到PDA液體培養(yǎng)基中，在28℃、180r/min的條件下培養(yǎng)，分別以灌根和傷口接種形式接種到健康植株上以確認(rèn)主要致病菌。并在孟加拉紅、PDA培養(yǎng)基上分別觀察菌落形態(tài)及菌絲孢囊形態(tài)，根據(jù)Booth[13]的方法進(jìn)行初步鑒定。

1.3分子生物學(xué)鑒定

真菌基因組提取采用CTAB法[14]，通過PCR擴(kuò)增菌株的ITS區(qū)域，測(cè)序后進(jìn)行基因?qū)Ρ辱b定，引物F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，引物R：TCCTCCGCTTATTGATAT。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30循環(huán)，最后72℃延伸10min;擴(kuò)增完成以后通過1%核酸凝膠電泳檢測(cè)，并送北京擎科生物測(cè)序。將測(cè)序序列在NCBI中通過BLAST對(duì)比確定致病菌種類。

1.4農(nóng)用拮抗菌篩選

將主要致病菌在PDA液體培養(yǎng)基中28℃、180r/min條件下培養(yǎng)3～5d形成均勻的懸浮菌液，吸取100μL菌懸液均勻涂布到PDA平板上，封口在30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7d，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的部位，鏟取0.5m2大小的3塊致病菌，均勻接種于馬鈴薯培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3d，取出后在培養(yǎng)基中心接種芽孢桿菌或者生防真菌，30℃培養(yǎng)3～5d觀察拮抗情況并記錄抑菌效果。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌分離與純化

通過對(duì)根部和莖基部病害區(qū)域的分離，共獲得3株純化菌株，在PDA斜面培養(yǎng)基上保存。將分離得到的純化菌落同時(shí)以6×106個(gè)孢子數(shù)澆灌和莖基部切傷處涂抹的方式接種到室內(nèi)盆栽培養(yǎng)的辣椒無菌苗上，發(fā)現(xiàn)只有1號(hào)致病呈萎蔫癥狀較明顯，在幼苗根部出現(xiàn)病斑，初為淺黃褐色，后呈褐色，最后變成黑色，病株地上部出現(xiàn)萎蔫，最后葉片發(fā)黃、枯死，與田間辣椒枯萎病表現(xiàn)癥狀相同，初步確定1號(hào)為主要致病菌。

2.2病原菌形態(tài)

將1號(hào)菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，菌絲為白色菌落邊緣呈紅色，羊毛狀至氈狀，菌落背面為紫紅色;大型分生孢子形態(tài)為鐮刀形，稍微彎曲，兩端尖，無色，大部分單生無分割，個(gè)別有1～3個(gè)分隔，孢子大小為（67.5～164.7）μm×（364.7～811.7）μm（圖1），初步確定為尖孢鐮刀菌。

2.3分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

通過引物對(duì)ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在530bp處存在1條清晰的條帶（圖2），經(jīng)測(cè)序后通過基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與尖孢鐮孢（Fusariumoxysporum）的相似度為99%，進(jìn)一步佐證了形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果是正確的。

2.4農(nóng)用拮抗微生物的篩選

共驗(yàn)證了14種常用生防菌與該病原菌的拮抗性，其中芽孢桿菌11株，有拮抗效果的8株，其中效果明顯的有6株，分別為枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌;抑制效果一般的有2株，分別為膠凍樣芽孢桿菌、多黏芽孢桿菌;無抑菌效果的有3株，分別為地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、高地芽孢桿菌（圖3、表1）;木霉菌3株，3株都存在抑菌效果，其中哈茨木霉抑菌效果最好，長(zhǎng)枝木霉次之，綠色木霉只有競(jìng)爭(zhēng)性抑制，效果不明顯（圖4、表1）。

3結(jié)論與討論

通過分離鑒定發(fā)現(xiàn)引起辣椒枯萎病的病原菌主要為尖孢鐮刀菌，并對(duì)該致病菌進(jìn)行了初步拮抗試驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)哈茨木霉菌和枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌都對(duì)該株尖孢鐮刀菌具有較好的抑制作用。其中哈茨木霉效果最佳，與此前研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉能夠有效抑制番茄、黃瓜、西瓜枯萎病的結(jié)果相似[15-16]，曹君等[17]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和哈茨木霉搭配后共同作用對(duì)棉花枯萎病有較強(qiáng)的抑制作用，充分證實(shí)芽孢桿菌、木霉菌能夠有效抑制植物病害的發(fā)生，在現(xiàn)有的發(fā)酵基礎(chǔ)上有效地將芽孢桿菌和木霉菌進(jìn)行復(fù)配，使其在作物根系周邊建立有效的防御群體，阻斷尖孢鐮刀菌的侵染，同時(shí)還能夠?qū)ψ魑锷L(zhǎng)起到一定的促進(jìn)作用[18-20]，該結(jié)果將減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，實(shí)現(xiàn)一個(gè)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的生物防治，為以后生物肥料、生物農(nóng)藥的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)利用微生物菌來防治植物病蟲害具有高效、經(jīng)濟(jì)、無副作用等優(yōu)點(diǎn)。另一方面該研究中篩選出的致病菌又可以作為靶向病原菌用于篩選土壤有益微生物，進(jìn)一步完善農(nóng)用微生物體系。

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