祁艷鳳 尚鳳芹 余云登 周金旭 王寧 王秀利

摘要 提取暗紋東方鲀肌肉的總RNA，采用RT-PCR的方法來克隆暗紋東方鲀MyoD基因的cDNA序列，并通過生物信息學(xué)分析，對(duì)該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行初步的分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為846 bp，共編碼了281個(gè)氨基酸，編碼蛋白為親水性非跨膜類蛋白，無信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明其與紅鰭東方鲀同源性最高，親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞 暗紋東方鲀;MyoD基因;基因克隆;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào) S 917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）08-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.024

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Cloning and Bioinformatics Analysis of MyoD Gene of Takifugu obscurus

QI Yan-feng，SHANG Feng-qin，YU Yun-deng et al （College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023）

Abstract The total RNA of Takifugu obscurus muscle was extracted，and the cDNA sequence of MyoD gene of Takifugu obscurus was cloned by RT-PCR method.And through bioinformatics analysis，preliminary analysis and prediction of the physicochemical properties，hydrophilicity and hydrophobicity，subcellular localization and protein structure of the protein encoded by the gene were carried out.The results showed that the full length of the coding region of the gene was 846 bp，which encoded a total of 281 amino acids.The encoded protein was a hydrophilic non-transmembrane protein with no signal peptide structure，and its subcellular location was in the nucleus.The results of phylogenetic tree analysis showed that it had the highest homology with the redfin puffer and the closest genetic relationship.

Key words Takifugu obscurus;MyoD gene;Gene cloning;Bioinformatics

生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族包括MyoD、MyoG、Myf5和Myf6 這4種調(diào)節(jié)因子，該家族在成肌細(xì)胞的發(fā)育和分化方面都起著絕對(duì)作用[1-6]。MyoD基因作為生肌調(diào)節(jié)因子家族中的重要一員，主要負(fù)責(zé)調(diào)控脊椎動(dòng)物胚胎期的肌肉發(fā)育，促進(jìn)骨骼肌的形成與分化，并可以通過多種途徑來達(dá)到激活肌肉轉(zhuǎn)錄的目的，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化;如果MyoD基因缺失，可導(dǎo)致成肌細(xì)胞無法進(jìn)行增殖和分化，從而影響個(gè)體正常的生長(zhǎng)和發(fā)育[7-13]。暗紋東方鲀的可食用部位主要是肌肉，而MyoD基因?qū)∪馍L(zhǎng)的調(diào)控作用是至關(guān)重要的，所以對(duì)暗紋東方鲀MyoD基因的研究對(duì)改良其肉質(zhì)有重要意義。

暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）別稱橫紋多紀(jì)鲀，屬于鲀形目、鲀科、東方鲀屬。暗紋東方鲀屬于暖溫性底層洄游性魚類，生活于近海地帶，在我國(guó)主要分布于黃海、東海、長(zhǎng)江中下游區(qū)域。春季親魚溯河生殖洄游進(jìn)入淡水江河直流進(jìn)行繁殖，幼魚在淡水中成長(zhǎng)[14]。暗紋東方鲀?nèi)赓|(zhì)雪白且少刺，味道尤為鮮嫩可口，不僅含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，而且還有多種人體所含的必需氨基酸以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，自古就享有“魚中之王”和“菜肴之冠”的美名。在一些亞洲國(guó)家如中國(guó)、日本和朝鮮都有著久遠(yuǎn)的食用暗紋東方鲀的飲食習(xí)慣，特別是在日本市場(chǎng)尤為暢銷，是我國(guó)十分重要的經(jīng)濟(jì)魚類。暗紋東方鲀能成功地在純淡水中養(yǎng)殖，有著很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，所以暗紋東方鲀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展是十分迅速的，目前養(yǎng)殖規(guī)模也比較大，其養(yǎng)殖區(qū)域正從沿海向內(nèi)地迅速擴(kuò)展。近幾年，沿岸的河豚資源量因過度開發(fā)而表現(xiàn)出每年急劇減少的趨勢(shì)，為滿足市場(chǎng)的需求，就要擴(kuò)大養(yǎng)殖河鲀的生產(chǎn)量[15-16]。目前在暗紋東方鲀的養(yǎng)殖技術(shù)方面研究比較廣泛，但對(duì)其基因水平的了解知之甚少，還沒有暗紋東方鲀MyoD基因組全序列的報(bào)道。該試驗(yàn)使用反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR方法，對(duì)暗紋東方鲀MyoD基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，研究其基因序列的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系及理化性質(zhì)，以期為進(jìn)一步探究魚類MyoD基因的結(jié)構(gòu)與功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來自江蘇南通中洋集團(tuán)，隨機(jī)選擇健康的3尾3月齡暗紋東方鲀幼魚作為基因克隆的試驗(yàn)樣本;提取RNA的Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq酶均購自TaKaRa生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 暗紋東方鲀總RNA提取與cDNA鏈合成。

剪取適量的暗紋東方鲀肌肉，加入液氮后進(jìn)行充分研磨，使用Trizol法來提取暗紋東方鲀的總RNA。提取后通過凝膠電泳檢測(cè)來驗(yàn)證RNA純度是否可以用于后續(xù)試驗(yàn)。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，共1個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 基因引物設(shè)計(jì)與合成。

參考紅鰭東方鲀的MyoD基因序列（NM_001032771）設(shè)計(jì)暗紋東方鲀MyoD基因 CDS區(qū)PCR引物。使用Primer Premier 5.0軟件來設(shè)計(jì)克隆基因編碼區(qū)全長(zhǎng)所需的引物。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成，所合成的引物序列如表l所示。

1.2.3 基因克隆。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用RT-PCR方法進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（25 μL）為ddH2O 14 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL，上游引物MyoD-F和下游引物MyoD-R各1 μL，模板 4 μL，Taq酶0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min進(jìn)入循環(huán);94 ℃變性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，結(jié)果所得條帶清晰符合測(cè)序要求，送往北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 編碼蛋白生物信息學(xué)分析。該研究主要使用了生物信息學(xué)分析網(wǎng)站（表2）來預(yù)測(cè)和分析了編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白跨膜區(qū)域、信號(hào)肽、親水性、疏水性、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)、蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期能夠?yàn)楹罄m(xù)分析該基因的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。其中進(jìn)化樹構(gòu)建中各物種氨基酸序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫，分別為紅鰭東方鲀（NP_001027941.1）、人（NP_002469.2）、斑馬魚（NP_571337.2）、羅非魚（XP_031601968.1）、金頭鯛（NM_030427111.1）、大口黑鱸（XP_643446.1）、非洲爪蟾（NP_001079366.1）、草魚（AFL56774.1）、大鼠（NP_788268.2）、豬（NP_001002824.1）、雞（NP_989545.2）、黃牛（NP_001035568.2）、綿羊（NP_001009390.1）、抹香鯨（XP_028357079.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀總RNA提取及檢測(cè)

使用Trizol法提取暗紋東方鲀肌肉的總RNA，其凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的RNA效果比較好，沒有蛋白的污染。圖1所展示的就是凝膠電泳檢測(cè)條帶，5S、18S和28S這3條帶明亮清晰，且寬度也比較適宜，再通過使用分光光度儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示D260nm/D280nm的值位于1.8～2.0，表明暗紋東方鲀肌肉的RNA提取效果良好，可以用于之后的試驗(yàn)研究。

2.2 基因克隆

通過PCR程序擴(kuò)增所得到的目的產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。在750～1 000 bp出現(xiàn)了一條清晰的DNA特異條帶，與預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段大小一致。由北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序，結(jié)果所得目的基因片段長(zhǎng)度為846 bp。將測(cè)序所得結(jié)果通過NCBI中的Blast程序與紅鰭東方鲀基因組數(shù)據(jù)庫該基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行對(duì)比后，二者相似度高達(dá)99%，僅在412 bp處發(fā)生1個(gè)堿基的變化（A→G），對(duì)應(yīng)所編碼的氨基酸也由蘇氨酸變成了丙氨酸。

2.3 生物信息學(xué)分析

通過反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR對(duì)暗紋東方鲀MyoD基因的cDNA進(jìn)行了克隆，得到了暗紋東方鲀MyoD基因CDS區(qū)序列。該編碼區(qū)長(zhǎng)度一共為846 bp，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG、TAA。通過Primer Premier 5.0將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，共翻譯編碼281個(gè)氨基酸，對(duì)其所編碼蛋白繼續(xù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2.3.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析。登陸ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi- bin/protparam/ protparam）分析MyoD基因氨基酸理化性質(zhì)，結(jié)果表明，氨基酸總數(shù)為281，其中Ser、Leu和Arg含量較多，分別為16.0%、8.5%和7.8%，不含Pyl和Sec，帶負(fù)電的殘基總數(shù)（Asp + Glu）為35，帶正電的殘基總數(shù)（Arg + Lys）為32，分子式為C1321H2078N398O436S14，分子量為30 960.28 Da，脂肪指數(shù)為62.56，理論等電點(diǎn)為6.41，親水性平均值（GRAVY）為-0.667，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為70.51，為不穩(wěn)定蛋白。

2.3.2 蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)。

通過TMHMM Sever v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）輸入暗紋東方鲀MyoD蛋白序列。暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)如圖3所示，其中X軸代表氨基酸殘基的數(shù)目，Y軸表示跨膜結(jié)構(gòu)可能性的分值（概率）;紅色線（transmembrane）代表跨膜區(qū);藍(lán)色線（inside）代表在膜內(nèi)部的概率，概率極低;粉色線（outside）代表在膜外的概率，幾乎100%。由此可見，該蛋白不存在跨膜區(qū)，且該蛋白全部在膜外。

2.3.3 暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白的信號(hào)肽分析。

利用軟件SignalP 5.0在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)無信號(hào)肽（圖4），說明MyoD基因所編碼的不是分泌蛋白。

2.3.4 暗紋東方鲀MyoD蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè)與分析。

利用位于Expasy的ProtScale在線分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的親疏水性分析，Amino acid scale選擇默認(rèn)的Hphob./Kyte & Doolittle，Window size設(shè)置為9，線性加權(quán)模型（圖5）。圖形的高峰值（正值）的區(qū)域體現(xiàn)的是疏水區(qū)域，而負(fù)值的“低谷”區(qū)域體現(xiàn)的是親水區(qū)域。正值越大的氨基酸具備更大的疏水性，負(fù)值越小的氨基酸則具備更大的親水性。通過對(duì)圖5的分析可得，該蛋白的氨基酸在97位處有最大值（1.544），在75和76位處有最小值（-2.533），MyoD蛋白表現(xiàn)為親水性。

2.3.5 蛋白亞細(xì)胞定位分析。

利用PSORT Ⅱ Prediction軟件對(duì)暗紋東方鲀MyoD蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，該蛋白在細(xì)胞核中分布最多，為56.5%;在細(xì)胞骨架中分布最少，為8.7%;細(xì)胞質(zhì)和線粒體分別為21.7%和13.0%。

2.3.6 暗紋東方鲀MyoD蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

利用NetPhos 3.1軟件來預(yù)測(cè)其磷酸化位點(diǎn)，在暗紋東方鲀MyoD基因編碼的氨基酸中共發(fā)現(xiàn)有82個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、15個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)（圖6）。

2.3.7 基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2.3.7.1 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和各功能取決于其空間結(jié)構(gòu)，利用PSIPRED在線分析軟件對(duì)MyoD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖7），從圖7可以看出二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的置信度（Conf）、二級(jí)結(jié)構(gòu)圖標(biāo)（Cart）、二級(jí)結(jié)構(gòu)字符表示（Pred）和氨基酸序列及編號(hào)（AA）。暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白序列中只含有α螺旋（Helix）、無規(guī)則卷曲（Coil）和β折疊（Strand），不含有β轉(zhuǎn)角以及其他已知的結(jié)構(gòu)域。2.3.7.2 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

登陸SWISS-MODEL網(wǎng)站（https：//www.swissmodel.ex-pasy.org/）預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖8所示。

2.3.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹。

使用MEGAX分子遺傳進(jìn)化分析軟件，對(duì)暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）和人（Homo sapiens）、斑馬魚（Danio rerio）、羅非魚（Oreochromis aureus）、金頭鯛（Sparus aurata）、大口黑鱸（Micropterus salmoides）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、大鼠（Rattus norvegicus）、豬（Sus scrofa）、雞（Gallus gallus）、黃牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、抹香鯨（Physeter catodon）14個(gè)物種以臨近相連算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，紅點(diǎn)為暗紋東方鲀分支。由進(jìn)化樹可表明，暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀的親緣關(guān)系最近;其次為羅非魚、大黑口鱸、金頭鯛。

3 討論與結(jié)論

MyoD基因第一次被成功克隆出來是由Davis在1987年所完成的。作為生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族的主要成員之一，MyoD基因不論是對(duì)骨骼肌的形成還是分化都起著十分重要的作用[17-19]。該研究首次克隆并測(cè)出暗紋東方鲀MyoD基因的CDS區(qū)核苷酸序列，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，得到其片段長(zhǎng)度為846 bp，共編碼281個(gè)氨基酸，這與紅鰭東方鲀MyoD基因編碼區(qū)一致。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，暗紋東方鲀MyoD基因A、G、T、C堿基分別為21.40%、26.12%、18.44%和34.04%，與紅鰭東方鲀MyoD基因堿基序列相似度為99%，僅在412 bp處有堿基A→G的變化，這一堿基的突變引起了氨基酸序列的改變，因此該位點(diǎn)突變應(yīng)為錯(cuò)義突變。將該序列與其他物種的MyoD基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀同源性最高，與哺乳動(dòng)物的同源性較低。這與傳統(tǒng)的生化特征分類和形態(tài)學(xué)分類的進(jìn)化地位是相符合的，進(jìn)一步說明 MyoD基因在對(duì)物種與物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究中是具有一定價(jià)值的[20-24]。

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，暗紋東方鲀MyoD基因分子量為30 960.28 Da，理論等電點(diǎn)為6.41，親水性平均值（GRAVY）為-0.667，脂肪指數(shù)為62.56，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為70.51，其多肽鏈表現(xiàn)出親水性，為不穩(wěn)定蛋白。通過軟件TMHMM和SignalP 5.0在線分析可知，MyoD蛋白全部在膜外且不存在跨膜區(qū)也無信號(hào)肽，說明其不是分泌蛋白，這個(gè)結(jié)果與MyoD基因只在骨骼肌細(xì)胞特異表達(dá)的組織特異性一致。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，暗紋東方鲀MyoD基因編碼蛋白序列中只含有α螺旋（Helix）、無規(guī)則卷曲（Coil）和β折疊（Strand），不含有β轉(zhuǎn)角以及其他已知的結(jié)構(gòu)域。由于暗紋東方鲀MyoD三級(jí)結(jié)構(gòu)僅有部分模型，因此無法預(yù)測(cè)完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MyoD基因存在磷酸化位點(diǎn)共102個(gè)，其中有82個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、15個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)，由此可以敲定，MyoD 蛋白在肌肉與骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中所起作用在一定程度上與這些磷酸化位點(diǎn)有著緊密聯(lián)系，其亞細(xì)胞主要定位在細(xì)胞核中。

該試驗(yàn)通過RT-PCR克隆了MyoD基因的編碼區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行了基礎(chǔ)的生物信息學(xué)分析，為以后對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究奠定了一定基礎(chǔ)，以期能夠?yàn)楦牧及导y東方鲀的肉質(zhì)作出貢獻(xiàn)。

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