牛琳琳，ZAW Lin Naing，張彩虹，EI Thinzar Soe，梁革梅

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

APNs（氨肽酶家族）屬于肽鏈端解酶，可使氨基酸從多肽鏈的N末端順序逐個地游離出來[1]，參與生物體內蛋白翻譯水平調控、肽激素水平調控、應激反應以及與健康和疾病相關的細胞反應等過程[2]。在昆蟲中，存在于消化道和腸腔中的APN，主要功能是與肽鏈內切酶和羧肽酶共同起作用，分解來自食物的蛋白[3]。研究者根據(jù)APNs的基因序列系統(tǒng)進化分析結果將鱗翅目昆蟲APNs分為8類，分別命名為APN1到APN8，每類分支中通常有多于一種的APN，同一物種的不同分支間氨基酸同源性為23%～40%，同一分支不同物種間的同源性為50%～95%[4,5]。目前，有143條APN的cDNA已經(jīng)從27種鱗翅目昆蟲中被克隆、分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

昆蟲中腸上的受體蛋白與Bt結合是Bt發(fā)揮殺蟲作用的關鍵，而且受體蛋白的變異與昆蟲對Bt的抗性密切相關。氨肽酶N是最早被鑒定出來的Bt受體蛋白[6]，煙草天蛾Manduca sexta的APN通過分離純化后可與Bt蛋白進行體外結合，是最早被確定的Cry1Ac受體[7]。2002年Gill等[8]采用顯微注射法獲得了含煙草天蛾APN基因的黑腹果蠅Drosophila melanogaster，APN在非敏感宿主果蠅中腸和中胚層獲得了表達，這種轉基因果蠅對Cry1Ac毒素變得很敏感，該研究首次從蟲體水平證實APN是Cry1Ac的功能性受體。Lin等[9]在Sf9昆蟲細胞中成功表達家蠶APN6，細胞生測結果顯示BmAPN6參與Cry1Ac誘導的細胞形態(tài)異常和裂解死亡過程。以往的研究結果表明，不同APN所結合的Cry蛋白種類不盡相同，而且昆蟲對Bt產生抗性后 APN基因的表達量變化也有差異，有的在抗性昆蟲中顯著降低，有的卻顯著升高。Pigott和Ellar[10]認為，APN在對Bt敏感性不同昆蟲中的表達量不同可能與APNs在不同種類昆蟲中作為Bt受體的相對重要性不同相關。因此，昆蟲APNs可能在不同Bt的殺蟲機制及抗性機制中發(fā)揮著不同的作用。

自1997年Bt棉花在我國種植以來，棉鈴蟲的為害得到了有效控制，但隨著種植年限的延長，棉鈴蟲對Cry1Ac的敏感性逐漸降低，抗性風險不容忽視[11]。Angelucci等[12]通過分析棉鈴蟲中腸的cDNA文庫發(fā)現(xiàn)了7種APN，其中有4種可以和Cry1Ac結合；我們實驗室也對棉鈴蟲APN進行了一系列研究，包括基因克隆、分離純化，并證實 HaAPN1是 Cry1Ac的受體、在幼蟲不同齡期中的表達量不同等[13-16]。對HaAPNs參與殺蟲機制、抗性機制中的功能也進行了探討，如HaAPN4可以與Cry1Ac、Cry2Aa都結合，沉默 APN4基因使棉鈴蟲對 Cry2Aa的敏感性降低；通過抗體封閉試驗證實 HaAPN1和 HaAPN4參與Cry1Ac、Cry2Aa棉鈴蟲的殺蟲過程[17-19]；HaAPN1片段缺失導致棉鈴蟲對Cry1Ac的抗性[20]；HaAPN1的表達量在不同水平的Cry1Ac抗性品系棉鈴蟲中都顯著降低，而HaAPN5在不同抗性品系中表現(xiàn)不同，有的升高有的降低[21]。但總體來說，對棉鈴蟲APN家族所有的基因缺乏系統(tǒng)的比較、分析，因此，無法全面評價不同APNs的作用。本研究我們克隆得到7個棉鈴蟲APN基因全長序列后，對HaAPNs進行了系統(tǒng)進化分析，并比較了HaAPN1?7基因在Cry1Ac敏感和抗性棉鈴蟲中的表達量，還分析了棉鈴蟲取食不同種類的Bt蛋白后APN活性的變化，以期系統(tǒng)地分析這7種APNs的功能，為進一步明確棉鈴蟲APNs在Bt殺蟲、抗性機制中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

96S敏感品系棉鈴蟲1996年采集自河南省新鄉(xiāng)縣棉田，在實驗室用人工飼料飼養(yǎng)至今，在此期間未接觸過任何殺蟲劑[22]。BtR品系是由96S敏感品系棉鈴蟲持續(xù)飼喂Cry1Ac蛋白篩選得到的，對Cry1Ac的抗性倍數(shù)超過1800倍。96S-Cry2Ab品系是由 96S敏感品系棉鈴蟲持續(xù)飼喂 Cry2Ab蛋白篩選得到的，對Cry2Ab的抗性倍數(shù)為28倍。96S-Vip3Aa品系是由96S敏感品系棉鈴蟲持續(xù)飼喂Vip3Aa蛋白篩選得到的，對Vip3Aa已具有一定耐受性。

各品系棉鈴蟲均在溫度（26±1）℃，光周期16L:8D，相對濕度（75±10）%的條件下飼養(yǎng)。

1.2 供試蛋白

Cry1Ac、Cry2Ab、Vip3Aa蛋白購自北京美延農業(yè)科技有限責任公司。

1.3 棉鈴蟲中腸總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

取棉鈴蟲5齡初幼蟲30頭，于冰上解剖截取中腸，在0.7% NaCl溶液中清洗掉中腸內含物，用濾紙吸干中腸的水分，液氮速凍后在-80 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?。棉鈴蟲中腸總RNA采用Trizol法進行提取[23]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性并用NanoDrop1000紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根公司）說明書，取2 μg總RNA進行反轉錄。

1.4 棉鈴蟲APNs全長基因克隆

分析GenBank上傳的棉鈴蟲APNs序列信息，對無APN全長的基因（APN4～7）先設計中間引物，然后進行3′ RACE PCR。按照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）（Takara公司）說明書以QT（表1）引物反轉錄得到的3′ cDNA為模板進行PCR。

表1 反轉錄和PCR所用引物Table 1 Primers used for reverse transcription and PCR

設計特異性引物以棉鈴蟲中腸cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL：cDNA模板2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，5×TransStart?FastPfu Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4μL，TransStart? FastPfu DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 31 μL。PCR 反應程序為：預變性 95 ℃ 1 min，1個循環(huán)；變性95 ℃ 20 s，退火55 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 2 kb/min，40個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min，1個循環(huán)。PCR產物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離和膠回收純化后連接到pEASY-Blunt Simple克隆載體上，轉化至Trans1-T1感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)后挑選陽性單克隆菌斑送至中美泰和有限公司進行測序。測序結果用NCBI-Blast進行同源序列檢索比對后用DNAMAN進行拼接得到全長序列。

1.5 棉鈴蟲APNs基因序列分析和系統(tǒng)進化樹構建

利用ExPaSy-PROSITE（http://web.expasy.org/compute_pi）預測APNs蛋白的分子量和等電點；利用NetNGLyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGLyc/）預測APNs蛋白的N-糖基化位點；利用NetOGLyc 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNOLyc/）預測APNs蛋白的O-糖基化位點；利用GPI-SOM（http://gpi.unibe.ch/）預測APNs蛋白的GPI（Glycosyl-phosphatidylinositol）錨定位點；在NCBI上搜索鱗翅目其他昆蟲的APN氨基酸序列，利用Mega 7軟件采用鄰接法構建已知鱗翅目昆蟲的APN系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.6 不同抗性品系棉鈴蟲APNs表達量差異分析

取各品系5齡初棉鈴蟲幼蟲90頭，30頭為一個生物學重復，共3次重復。棉鈴蟲中腸提取、中腸總RNA提取及cDNA第一鏈的合成同1.3。

根據(jù)擴增得到的棉鈴蟲APN1～7基因全長序列設計實時熒光定量PCR引物（表2），內參引物選用核糖體蛋白S15基因（RPS15）。所有引物均進行熒光定量PCR驗證擴增效率。熒光定量PCR采用SYBR Green染料法。不同抗性品系APNs表達量差異分析利用本步驟中合成的cDNA，PCR反應體系為20 μL，組分為 2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向和反向引物各 0.6 μL，cDNA 模板 1 μL，50×ROX Reference Dye△0.4 μL，ddH2O 7.4 μL，PCR 程序按照 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根公司）試劑盒說明書進行。

表2 熒光定量PCR所用引物Table 2 Primers used in qPCR

APNs表達量差異以內參基因（RPS15）表達量為標準參照，用2-△△Ct相對定量法計算APNs的表達量差異[24]。用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，采用Tukey檢驗進行處理間差異顯著性分析。

1.7 中腸酶液和BBMV中的APN活性的測定

將配制好的棉鈴蟲人工飼料切成邊長約為0.5 cm的正方體小塊，加到24孔昆蟲飼養(yǎng)板中。用25 mmol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH 10.5）將Bt蛋白稀釋成需要濃度，按照0～6.25 μg/larva劑量添加Bt蛋白到飼料表面，待Bt蛋白完全滲入飼料后，將預先饑餓4 h后的5齡初棉鈴蟲幼蟲接到飼料上。每處理接蟲24頭，重復3次。待棉鈴蟲將各處理飼料取食殆盡（8 h），收集幼蟲。

于冰上解剖各處理棉鈴蟲，將中腸及內含物取出置于2 mL離心管中，加入預冷的1 mL 150 mmol/L NaCl，微量組織研磨器研磨約10 s，4 ℃、12000 r/min離心15 min，吸取上清液于新的離心管中，再重復離心一次，上清液即為中腸酶液。棉鈴蟲中腸BBMV提取參照Wolfersberger等[25]的方法進行。利用Bradford法測定中腸酶液和BBMV中總蛋白濃度。

參照Watanabe等[26]和Takesue等[27]的方法，以1 mg/L LpNA的甲醇儲備液作為反應底物，在96孔酶標板中每孔加入5 μL樣品和195 μL底物溶液，37 ℃反應60 min后，405 nm波長下測量吸光值。

APN活性計算方法：U＝（△A/△t）×（V總反應體積/v樣品體積）×（1000/?）μmol/min（消光系數(shù)?＝9.9/mmol/cm）；APN 特異活性＝U/mg protein＝（△A×264.0787）/蛋白濃度，APN 活力單位為μmol/min/mg protein。

數(shù)據(jù)分析同1.6。

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲APNs基因序列分析

通過 PCR克隆得到的 7條棉鈴蟲APN基因全長序列HaAPN 1～7，已上傳至 GenBank，登錄號為MT002819～MT002825。經(jīng) ExPaSy-PROSITE、GPI-SOM 等生物信息學網(wǎng)站分析，HaAPN 1～7全長為2592～3099 bp，編碼863～1032個氨基酸，分子量為110～115 kDa，等電點為4.7～6.4，N端信號肽為15～20 aa。除HaAPN7以外，HaAPN1～6都有GAMENWG和HEX2HX18E基序；HaAPN1、HaAPN2，HaAPN3的C末端都有一段多聚蘇氨酸序列；HaAPN1～7蛋白C末端都有一個GPI錨定位點；HaAPN1、HaAPN2，HaAPN3的O-糖基化位點有16～39個；除了HaAPN2無N-糖基化位點，其余HaAPNs均有1～8個N-糖基化位點。具體序列信息分析見表3。

表3 棉鈴蟲APN1～7生物信息學分析Table 3 Bioinformatics analysis of HaAPN1—7

2.2 棉鈴蟲APNs系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI下載了22種鱗翅目昆蟲APN氨基酸序列共86條（包括本研究所克隆的7條HaAPNs序列），利用Clustal W進行多序列比對，采用Neighbor-Joining構建鱗翅目APN系統(tǒng)發(fā)育進化樹（bootstrap＝1000），結果顯示鱗翅目在進化上分為9個分支，其中棉鈴蟲APN1～7基因分別在其中的7個分支Class 1～7上。Class 1中包括16個物種；Class 2中包括11個物種；Class 3共有17個物種，Class 3在進化關系上與Class 1的親緣關系最近，但與Class 1相比O-糖基化位點更少；Class 4與Class 2一樣C末端無蘇氨酸富集區(qū)，此類別包含11個物種；Class 5中包含8個物種，Class 6中包含6個物種；Class 7～9中僅包含2～3個物種。從棉鈴蟲APN進化上的親緣關系上來看，棉鈴蟲APN1與澳洲棉鈴蟲Helicoverpa punctigera、煙芽夜蛾Heliothis virescens、甜菜夜蛾Spodoptera exigua的APN1親緣關系較近；棉鈴蟲APN2與甜菜夜蛾APN5、粉紋夜蛾Trichoplusia ni APN5親緣關系較近；棉鈴蟲APN3與澳洲棉鈴蟲APN3親緣關系最近；棉鈴蟲APN4與澳洲棉鈴蟲APN2親緣關系最近；棉鈴蟲APN5與粉紋夜蛾APN2親緣關系最近；棉鈴蟲APN6與甜菜夜蛾APN6親緣關系最近；棉鈴蟲APN7與歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis APN7親緣關系最近（圖1）。

圖1 鱗翅目昆蟲APNs進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Lepidoptera insects APNs

2.3 Cry1Ac敏感和抗性品系棉鈴蟲中HaAPN1～7表達量

在96S敏感棉鈴蟲中HaAPNs表達量差異顯著（F6,21＝343，P＜0.0001），表達量由高到低依次為HaAPN2，HaAPN1，HaAPN4，HaAPN3，HaAPN5，HaAPN6，HaAPN7，其中HaAPN2的表達量比HaAPN1高約1倍且達到顯著水平（P＝0.002）；HaAPN4的表達量顯著低于HaAPN1（P＜0.0001），HaAPN3的表達量顯著低于HaAPN4（P＝0.001）；HaAPN5與HaAPN3表達量差異不顯著（P＝0.38）；HaAPN5～7表達量差異不顯著（P＞0.57）（圖2A）。

在 BtR抗性棉鈴蟲中 HaAPNs表達量差異顯著（F6,21＝184，P＜0.0001），表達量由高到低依次為HaAPN2、HaAPN1、HaAPN4、HaAPN3、HaAPN5、HaAPN6和 HaAPN7，其中 HaAPN2的表達量比 HaAPN1高約2倍且達到顯著水平（P＜0.0001）；HaAPN3～6表達量均顯著低于HaAPN1（P＜0.0001）；HaAPN3～7表達量無顯著差異（P＞0.07）（圖2B）。

圖2 Cry1Ac敏感（A）和抗性（B）品系棉鈴蟲中HaAPN1～7表達量Fig. 2 Expression level of HaAPN1—7 in Cry1Ac-susceptible (A) and -resistant (B) strain

2.4 敏感品系棉鈴蟲取食不同Bt蛋白后中腸APN活性的變化

取食Cry1Ac蛋白后，96S棉鈴蟲中腸APN活性變化明顯（中腸酶液: F6,14＝7.33，P＝0.001；BBMV：F6,14＝457，P＜0.0001），與取食正常飼料的棉鈴蟲相比，2 ng/larva（P＝0.0009）、50 ng/larva（P＝0.018）和0.25 μg/larva（P＝0.003）劑量處理的棉鈴蟲中腸酶液中APN活性顯著下降；所有不同Cry1Ac劑量處理的棉鈴蟲中腸BBMV中APN活性與對照相比顯著下降（P＜0.0001）。取食Cry2Ab蛋白后（F6,14＝2.11,P＝0.117），中腸酶液中APN活性無顯著變化（P＞0.18）；但與對照相比，所有劑量處理中腸BBMV中APN活性都顯著降低（F5,12＝181，P＜0.0001；1.25 μg/larva：P＝0.029；其余劑量：P＜0.0001）。取食Vip3Aa蛋白后，與對照相比，各個處理中腸酶液中APN活性顯著降低（F5,12＝144，P＜0.0001；所有劑量：P＜0.0001）；除了10 ng/larva劑量處理外，中腸BBMV中APN活性也都顯著降低（F5,12＝117，P＜0.0001；10 ng/larva：P＝0.965；其余劑量：P＜0.0001）（圖3）。

圖3 取食不同Bt蛋白后敏感品系棉鈴蟲中腸APN活性Fig. 3 APN activity in the midgut of Helicoverpa armigera susceptible larvae after fed different Bt proteins

2.5 不同Bt抗性品系棉鈴蟲中腸APN活性的比較

與96S敏感品系棉鈴蟲相比，各Bt抗性品系棉鈴蟲中腸APN活性顯著降低（中腸酶液：F3,8＝32.9，P＜0.0001；BBMV：F3,8＝21.3，P＝0.0004），其中BtR品系（P＝0.0004）和96S-Vip3Aa品系（P＝0.004）棉鈴蟲中腸酶液中APN活性顯著降低，96S-Cry2Ab品系與96S無顯著差異（P＝0.564）；而在BBMV中，與96S棉鈴蟲相比，96S-Vip3Aa品系（P＝0.0004）APN活性顯著降低，96S-Cry2Ab品系（P＝0.056）和BtR品系與敏感品系差異不顯著（P＝0.841）（圖4）。

圖4 不同Bt抗性品系棉鈴蟲中腸APN活性的差異Fig. 4 Differences of APN activity in the midgut of Helicoverpa armigera from different Bt resistant strains

3 討論

鱗翅目昆蟲中腸APNs的分子量從100到180 kDa不等，具有多個保守區(qū)域，從蛋白的N端到C端依次為信號肽、蛋白前體區(qū)、GAMENWG基序、HEX2HX18E鋅指結構基序、蘇氨酸富集區(qū)、糖基磷脂酰肌醇（Glycosyl-phosphalidylinositol，GPI）錨定信號位點[28]。本研究克隆得到的HaAPN1～7都具有這些APN家族的共同特征。HaAPN1～7中，只有APN7沒有保守的GAMENWG基序和HEX2HX18E鋅指結構基序，證明APN7不是一個有活性的氨肽酶N基因[12]。棉鈴蟲APN4～7基因C末端沒有蘇氨酸富集區(qū)，此區(qū)域也是APN的O-糖基化位點；具有蘇氨酸富集區(qū)的APN1～3含有的O-糖基化位點的個數(shù)也不相同，HaAPN1和HaAPN2分別有39和31個O-糖基化位點，HaAPN3有16個（表3）。相比于O-糖基化位點，每個棉鈴蟲的APN基因只有少數(shù)幾個N-糖基化位點，其中HaAPN2無N-糖基化位點。APN的糖基化位點通常被認為可能是Cry1Ac的結合區(qū)域[10,12]，不同APN糖基化位點的差異可能是APNs與不同Bt蛋白結合存在差異的主要原因。例如，Cry1Ca蛋白與煙草天蛾106 kDa 的APN 結合、但不能和115 kDa大小的APN結合[29]；歐洲玉米螟中APN1結合Cry1Ab和Cry1Fa，APN3a、APN8只結合Cry1Fa，APN2、APN3b，與Cry1Ab和Cry1Fa都不結合[30]；棉鈴蟲APN1～4均可以和Cry1Ac結合[12]，其中APN1除了能與Cry1Ac結合外還能與Cry1Aa和Cry1Ab結合，APN2則只能與Cry1Ac結合[20,21,31]。因此，我們推測棉鈴蟲APN1～6與不同的Bt可能存在不同的結合譜。

Pigott and Ellar[10]進行系統(tǒng)發(fā)育分析后將鱗翅目序列劃分為5個類群，隨著基因組測序技術的發(fā)展，越來越多昆蟲的APN同工酶序列被克隆出來，鱗翅目APNs又進一步被細致地分為8個類群[4]，在此基礎上Hughes[5]基于鱗翅目APNs的保守衍生基序，去掉Class7分支后加上雙翅目APNs，然后重新分析了鱗翅目APNs的系統(tǒng)發(fā)育情況[5]。本研究整合目前在NCBI上的鱗翅目APNs全長序列，除去無信號肽和GPI錨定位點的PSA（puromycin-sensitive amino）類APN[4]，進行系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為9個類群，Class 1～9。目前，不同類群APN均有作為Bt受體的報道，其中Class1～4類群APNs與Cry蛋白的相互作用研究較為廣泛，Class 1中煙草天蛾APN1[32]、小菜蛾PxAPN-A[33]、棉鈴蟲APN1[20,31]、粉紋夜蛾APN1[34]已報道為Cry1Ac的受體；Class 2中煙草天蛾APN2可以與Cry1Ab5結合[7]；Class 3中家蠶和小菜蛾APN3[35]、棉鈴蟲APN3[3]、煙芽夜蛾120 kDa APN[37]、舞毒蛾APN1[38]可作為Cry1A的結合蛋白也有相關報道；Class 4中家蠶和小菜蛾的APN4可以與Cry1Aa、Cry1Ab結合[35]。Class 5～9類群作為Cry蛋白的受體報道還很少。

為了明確APN在Bt殺蟲或抗性機制中的作用，人們常用RNAi技術干擾APN的表達來明確其功能，如通過降低棉鈴蟲、美國白蛾、甜菜夜蛾、二點委夜蛾Athetis lepigone等的APN基因表達量，證實了APN是Cry類蛋白的受體[39-42]。APN突變或表達量的改變與棉鈴蟲[20]、甜菜夜蛾[43]、粉紋夜蛾[34]等對Cry1類蛋白的抗性相關。我們的研究結果顯示棉鈴蟲中腸APN1～7的表達量存在顯著差異，其中APN2的表達量最高，APN7的表達量最低；而且Cry1Ac抗性品系棉鈴蟲中各類APN的表達趨勢與敏感品系一致。我們推測，HaAPN1～7可能在分解蛋白、作為結合受體等方面有不同的重要性。

Chougule等[44]曾報道，取食不同的飼料會造成棉鈴蟲APNs表達量的差異；Cry1Ab抗性品系小蔗螟APN蛋白酶活性和表達量較敏感品系都顯著降低，敏感幼蟲APN被RNAi后，APN活性降低、對Cry1Ab敏感性降低[45]。我們的研究結果顯示敏感品系棉鈴蟲取食Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa蛋白后中腸APN活性顯著降低，其中取食Cry1Ac和Vip3Aa蛋白后中腸酶液中APN活性顯著降低，取食Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa蛋白后中腸BBMV上APN活性都顯著降低（圖3）。棉鈴蟲對Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa產生耐受性后，中腸酶液和 BBMV中APN活性也發(fā)生了顯著變化，而且與96S棉鈴蟲相比，BtR品系和96S-Vip3Aa品系棉鈴蟲中腸酶液中APN活性顯著降低，96S-Vip3Aa品系棉鈴蟲BBMV中APN活性顯著降低（圖4）。說明棉鈴蟲取食不同的Bt或對不同Bt有耐受性后，在中腸酶液中和BBMV上APN的活性變化不同。由此，我們推測棉鈴蟲APN活性的變化與Bt蛋白的降解及抗性演化相關，但具體的功能有待以后進一步驗證。