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        棉鈴蟲(chóng)APN基因家族系統(tǒng)進(jìn)化與功能分析

        2021-05-11 10:30:56牛琳琳ZAWLinNaing張彩虹EIThinzarSoe梁革梅
        關(guān)鍵詞:中腸棉鈴蟲(chóng)糖基化

        牛琳琳,ZAW Lin Naing,張彩虹,EI Thinzar Soe,梁革梅

        (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

        APNs(氨肽酶家族)屬于肽鏈端解酶,可使氨基酸從多肽鏈的N末端順序逐個(gè)地游離出來(lái)[1],參與生物體內(nèi)蛋白翻譯水平調(diào)控、肽激素水平調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)以及與健康和疾病相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)等過(guò)程[2]。在昆蟲(chóng)中,存在于消化道和腸腔中的APN,主要功能是與肽鏈內(nèi)切酶和羧肽酶共同起作用,分解來(lái)自食物的蛋白[3]。研究者根據(jù)APNs的基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果將鱗翅目昆蟲(chóng)APNs分為8類,分別命名為APN1到APN8,每類分支中通常有多于一種的APN,同一物種的不同分支間氨基酸同源性為23%~40%,同一分支不同物種間的同源性為50%~95%[4,5]。目前,有143條APN的cDNA已經(jīng)從27種鱗翅目昆蟲(chóng)中被克隆、分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

        昆蟲(chóng)中腸上的受體蛋白與Bt結(jié)合是Bt發(fā)揮殺蟲(chóng)作用的關(guān)鍵,而且受體蛋白的變異與昆蟲(chóng)對(duì)Bt的抗性密切相關(guān)。氨肽酶N是最早被鑒定出來(lái)的Bt受體蛋白[6],煙草天蛾Manduca sexta的APN通過(guò)分離純化后可與Bt蛋白進(jìn)行體外結(jié)合,是最早被確定的Cry1Ac受體[7]。2002年Gill等[8]采用顯微注射法獲得了含煙草天蛾APN基因的黑腹果蠅Drosophila melanogaster,APN在非敏感宿主果蠅中腸和中胚層獲得了表達(dá),這種轉(zhuǎn)基因果蠅對(duì)Cry1Ac毒素變得很敏感,該研究首次從蟲(chóng)體水平證實(shí)APN是Cry1Ac的功能性受體。Lin等[9]在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)家蠶APN6,細(xì)胞生測(cè)結(jié)果顯示BmAPN6參與Cry1Ac誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)異常和裂解死亡過(guò)程。以往的研究結(jié)果表明,不同APN所結(jié)合的Cry蛋白種類不盡相同,而且昆蟲(chóng)對(duì)Bt產(chǎn)生抗性后 APN基因的表達(dá)量變化也有差異,有的在抗性昆蟲(chóng)中顯著降低,有的卻顯著升高。Pigott和Ellar[10]認(rèn)為,APN在對(duì)Bt敏感性不同昆蟲(chóng)中的表達(dá)量不同可能與APNs在不同種類昆蟲(chóng)中作為Bt受體的相對(duì)重要性不同相關(guān)。因此,昆蟲(chóng)APNs可能在不同Bt的殺蟲(chóng)機(jī)制及抗性機(jī)制中發(fā)揮著不同的作用。

        自1997年Bt棉花在我國(guó)種植以來(lái),棉鈴蟲(chóng)的為害得到了有效控制,但隨著種植年限的延長(zhǎng),棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的敏感性逐漸降低,抗性風(fēng)險(xiǎn)不容忽視[11]。Angelucci等[12]通過(guò)分析棉鈴蟲(chóng)中腸的cDNA文庫(kù)發(fā)現(xiàn)了7種APN,其中有4種可以和Cry1Ac結(jié)合;我們實(shí)驗(yàn)室也對(duì)棉鈴蟲(chóng)APN進(jìn)行了一系列研究,包括基因克隆、分離純化,并證實(shí) HaAPN1是 Cry1Ac的受體、在幼蟲(chóng)不同齡期中的表達(dá)量不同等[13-16]。對(duì)HaAPNs參與殺蟲(chóng)機(jī)制、抗性機(jī)制中的功能也進(jìn)行了探討,如HaAPN4可以與Cry1Ac、Cry2Aa都結(jié)合,沉默 APN4基因使棉鈴蟲(chóng)對(duì) Cry2Aa的敏感性降低;通過(guò)抗體封閉試驗(yàn)證實(shí) HaAPN1和 HaAPN4參與Cry1Ac、Cry2Aa棉鈴蟲(chóng)的殺蟲(chóng)過(guò)程[17-19];HaAPN1片段缺失導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac的抗性[20];HaAPN1的表達(dá)量在不同水平的Cry1Ac抗性品系棉鈴蟲(chóng)中都顯著降低,而HaAPN5在不同抗性品系中表現(xiàn)不同,有的升高有的降低[21]。但總體來(lái)說(shuō),對(duì)棉鈴蟲(chóng)APN家族所有的基因缺乏系統(tǒng)的比較、分析,因此,無(wú)法全面評(píng)價(jià)不同APNs的作用。本研究我們克隆得到7個(gè)棉鈴蟲(chóng)APN基因全長(zhǎng)序列后,對(duì)HaAPNs進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析,并比較了HaAPN1?7基因在Cry1Ac敏感和抗性棉鈴蟲(chóng)中的表達(dá)量,還分析了棉鈴蟲(chóng)取食不同種類的Bt蛋白后APN活性的變化,以期系統(tǒng)地分析這7種APNs的功能,為進(jìn)一步明確棉鈴蟲(chóng)APNs在Bt殺蟲(chóng)、抗性機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 供試蟲(chóng)源

        96S敏感品系棉鈴蟲(chóng)1996年采集自河南省新鄉(xiāng)縣棉田,在實(shí)驗(yàn)室用人工飼料飼養(yǎng)至今,在此期間未接觸過(guò)任何殺蟲(chóng)劑[22]。BtR品系是由96S敏感品系棉鈴蟲(chóng)持續(xù)飼喂Cry1Ac蛋白篩選得到的,對(duì)Cry1Ac的抗性倍數(shù)超過(guò)1800倍。96S-Cry2Ab品系是由 96S敏感品系棉鈴蟲(chóng)持續(xù)飼喂 Cry2Ab蛋白篩選得到的,對(duì)Cry2Ab的抗性倍數(shù)為28倍。96S-Vip3Aa品系是由96S敏感品系棉鈴蟲(chóng)持續(xù)飼喂Vip3Aa蛋白篩選得到的,對(duì)Vip3Aa已具有一定耐受性。

        各品系棉鈴蟲(chóng)均在溫度(26±1)℃,光周期16L:8D,相對(duì)濕度(75±10)%的條件下飼養(yǎng)。

        1.2 供試蛋白

        Cry1Ac、Cry2Ab、Vip3Aa蛋白購(gòu)自北京美延農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司。

        1.3 棉鈴蟲(chóng)中腸總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

        取棉鈴蟲(chóng)5齡初幼蟲(chóng)30頭,于冰上解剖截取中腸,在0.7% NaCl溶液中清洗掉中腸內(nèi)含物,用濾紙吸干中腸的水分,液氮速凍后在-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。棉鈴蟲(chóng)中腸總RNA采用Trizol法進(jìn)行提取[23],用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性并用NanoDrop1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。

        按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根公司)說(shuō)明書(shū),取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

        1.4 棉鈴蟲(chóng)APNs全長(zhǎng)基因克隆

        分析GenBank上傳的棉鈴蟲(chóng)APNs序列信息,對(duì)無(wú)APN全長(zhǎng)的基因(APN4~7)先設(shè)計(jì)中間引物,然后進(jìn)行3′ RACE PCR。按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(Takara公司)說(shuō)明書(shū)以QT(表1)引物反轉(zhuǎn)錄得到的3′ cDNA為模板進(jìn)行PCR。

        表1 反轉(zhuǎn)錄和PCR所用引物Table 1 Primers used for reverse transcription and PCR

        設(shè)計(jì)特異性引物以棉鈴蟲(chóng)中腸cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL:cDNA模板2 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,5×TransStart?FastPfu Buffer 10 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4μL,TransStart? FastPfu DNA Polymerase 1 μL,ddH2O 31 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性 95 ℃ 1 min,1個(gè)循環(huán);變性95 ℃ 20 s,退火55 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 2 kb/min,40個(gè)循環(huán);終延伸72 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離和膠回收純化后連接到pEASY-Blunt Simple克隆載體上,轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)后挑選陽(yáng)性單克隆菌斑送至中美泰和有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用NCBI-Blast進(jìn)行同源序列檢索比對(duì)后用DNAMAN進(jìn)行拼接得到全長(zhǎng)序列。

        1.5 棉鈴蟲(chóng)APNs基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

        利用ExPaSy-PROSITE(http://web.expasy.org/compute_pi)預(yù)測(cè)APNs蛋白的分子量和等電點(diǎn);利用NetNGLyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGLyc/)預(yù)測(cè)APNs蛋白的N-糖基化位點(diǎn);利用NetOGLyc 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNOLyc/)預(yù)測(cè)APNs蛋白的O-糖基化位點(diǎn);利用GPI-SOM(http://gpi.unibe.ch/)預(yù)測(cè)APNs蛋白的GPI(Glycosyl-phosphatidylinositol)錨定位點(diǎn);在NCBI上搜索鱗翅目其他昆蟲(chóng)的APN氨基酸序列,利用Mega 7軟件采用鄰接法構(gòu)建已知鱗翅目昆蟲(chóng)的APN系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

        1.6 不同抗性品系棉鈴蟲(chóng)APNs表達(dá)量差異分析

        取各品系5齡初棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)90頭,30頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù),共3次重復(fù)。棉鈴蟲(chóng)中腸提取、中腸總RNA提取及cDNA第一鏈的合成同1.3。

        根據(jù)擴(kuò)增得到的棉鈴蟲(chóng)APN1~7基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表2),內(nèi)參引物選用核糖體蛋白S15基因(RPS15)。所有引物均進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證擴(kuò)增效率。熒光定量PCR采用SYBR Green染料法。不同抗性品系A(chǔ)PNs表達(dá)量差異分析利用本步驟中合成的cDNA,PCR反應(yīng)體系為20 μL,組分為 2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,正向和反向引物各 0.6 μL,cDNA 模板 1 μL,50×ROX Reference Dye△0.4 μL,ddH2O 7.4 μL,PCR 程序按照 SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(天根公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

        表2 熒光定量PCR所用引物Table 2 Primers used in qPCR

        APNs表達(dá)量差異以內(nèi)參基因(RPS15)表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參照,用2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算APNs的表達(dá)量差異[24]。用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行處理間差異顯著性分析。

        1.7 中腸酶液和BBMV中的APN活性的測(cè)定

        將配制好的棉鈴蟲(chóng)人工飼料切成邊長(zhǎng)約為0.5 cm的正方體小塊,加到24孔昆蟲(chóng)飼養(yǎng)板中。用25 mmol/L Na2CO3/NaHCO3緩沖液(pH 10.5)將Bt蛋白稀釋成需要濃度,按照0~6.25 μg/larva劑量添加Bt蛋白到飼料表面,待Bt蛋白完全滲入飼料后,將預(yù)先饑餓4 h后的5齡初棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)接到飼料上。每處理接蟲(chóng)24頭,重復(fù)3次。待棉鈴蟲(chóng)將各處理飼料取食殆盡(8 h),收集幼蟲(chóng)。

        于冰上解剖各處理棉鈴蟲(chóng),將中腸及內(nèi)含物取出置于2 mL離心管中,加入預(yù)冷的1 mL 150 mmol/L NaCl,微量組織研磨器研磨約10 s,4 ℃、12000 r/min離心15 min,吸取上清液于新的離心管中,再重復(fù)離心一次,上清液即為中腸酶液。棉鈴蟲(chóng)中腸BBMV提取參照Wolfersberger等[25]的方法進(jìn)行。利用Bradford法測(cè)定中腸酶液和BBMV中總蛋白濃度。

        參照Watanabe等[26]和Takesue等[27]的方法,以1 mg/L LpNA的甲醇儲(chǔ)備液作為反應(yīng)底物,在96孔酶標(biāo)板中每孔加入5 μL樣品和195 μL底物溶液,37 ℃反應(yīng)60 min后,405 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光值。

        APN活性計(jì)算方法:U=(△A/△t)×(V總反應(yīng)體積/v樣品體積)×(1000/?)μmol/min(消光系數(shù)?=9.9/mmol/cm);APN 特異活性=U/mg protein=(△A×264.0787)/蛋白濃度,APN 活力單位為μmol/min/mg protein。

        數(shù)據(jù)分析同1.6。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 棉鈴蟲(chóng)APNs基因序列分析

        通過(guò) PCR克隆得到的 7條棉鈴蟲(chóng)APN基因全長(zhǎng)序列HaAPN 1~7,已上傳至 GenBank,登錄號(hào)為MT002819~MT002825。經(jīng) ExPaSy-PROSITE、GPI-SOM 等生物信息學(xué)網(wǎng)站分析,HaAPN 1~7全長(zhǎng)為2592~3099 bp,編碼863~1032個(gè)氨基酸,分子量為110~115 kDa,等電點(diǎn)為4.7~6.4,N端信號(hào)肽為15~20 aa。除HaAPN7以外,HaAPN1~6都有GAMENWG和HEX2HX18E基序;HaAPN1、HaAPN2,HaAPN3的C末端都有一段多聚蘇氨酸序列;HaAPN1~7蛋白C末端都有一個(gè)GPI錨定位點(diǎn);HaAPN1、HaAPN2,HaAPN3的O-糖基化位點(diǎn)有16~39個(gè);除了HaAPN2無(wú)N-糖基化位點(diǎn),其余HaAPNs均有1~8個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。具體序列信息分析見(jiàn)表3。

        表3 棉鈴蟲(chóng)APN1~7生物信息學(xué)分析Table 3 Bioinformatics analysis of HaAPN1—7

        2.2 棉鈴蟲(chóng)APNs系統(tǒng)發(fā)育分析

        從NCBI下載了22種鱗翅目昆蟲(chóng)APN氨基酸序列共86條(包括本研究所克隆的7條HaAPNs序列),利用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì),采用Neighbor-Joining構(gòu)建鱗翅目APN系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(bootstrap=1000),結(jié)果顯示鱗翅目在進(jìn)化上分為9個(gè)分支,其中棉鈴蟲(chóng)APN1~7基因分別在其中的7個(gè)分支Class 1~7上。Class 1中包括16個(gè)物種;Class 2中包括11個(gè)物種;Class 3共有17個(gè)物種,Class 3在進(jìn)化關(guān)系上與Class 1的親緣關(guān)系最近,但與Class 1相比O-糖基化位點(diǎn)更少;Class 4與Class 2一樣C末端無(wú)蘇氨酸富集區(qū),此類別包含11個(gè)物種;Class 5中包含8個(gè)物種,Class 6中包含6個(gè)物種;Class 7~9中僅包含2~3個(gè)物種。從棉鈴蟲(chóng)APN進(jìn)化上的親緣關(guān)系上來(lái)看,棉鈴蟲(chóng)APN1與澳洲棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa punctigera、煙芽夜蛾Heliothis virescens、甜菜夜蛾Spodoptera exigua的APN1親緣關(guān)系較近;棉鈴蟲(chóng)APN2與甜菜夜蛾APN5、粉紋夜蛾Trichoplusia ni APN5親緣關(guān)系較近;棉鈴蟲(chóng)APN3與澳洲棉鈴蟲(chóng)APN3親緣關(guān)系最近;棉鈴蟲(chóng)APN4與澳洲棉鈴蟲(chóng)APN2親緣關(guān)系最近;棉鈴蟲(chóng)APN5與粉紋夜蛾APN2親緣關(guān)系最近;棉鈴蟲(chóng)APN6與甜菜夜蛾APN6親緣關(guān)系最近;棉鈴蟲(chóng)APN7與歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis APN7親緣關(guān)系最近(圖1)。

        圖1 鱗翅目昆蟲(chóng)APNs進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of Lepidoptera insects APNs

        2.3 Cry1Ac敏感和抗性品系棉鈴蟲(chóng)中HaAPN1~7表達(dá)量

        在96S敏感棉鈴蟲(chóng)中HaAPNs表達(dá)量差異顯著(F6,21=343,P<0.0001),表達(dá)量由高到低依次為HaAPN2,HaAPN1,HaAPN4,HaAPN3,HaAPN5,HaAPN6,HaAPN7,其中HaAPN2的表達(dá)量比HaAPN1高約1倍且達(dá)到顯著水平(P=0.002);HaAPN4的表達(dá)量顯著低于HaAPN1(P<0.0001),HaAPN3的表達(dá)量顯著低于HaAPN4(P=0.001);HaAPN5與HaAPN3表達(dá)量差異不顯著(P=0.38);HaAPN5~7表達(dá)量差異不顯著(P>0.57)(圖2A)。

        在 BtR抗性棉鈴蟲(chóng)中 HaAPNs表達(dá)量差異顯著(F6,21=184,P<0.0001),表達(dá)量由高到低依次為HaAPN2、HaAPN1、HaAPN4、HaAPN3、HaAPN5、HaAPN6和 HaAPN7,其中 HaAPN2的表達(dá)量比 HaAPN1高約2倍且達(dá)到顯著水平(P<0.0001);HaAPN3~6表達(dá)量均顯著低于HaAPN1(P<0.0001);HaAPN3~7表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.07)(圖2B)。

        圖2 Cry1Ac敏感(A)和抗性(B)品系棉鈴蟲(chóng)中HaAPN1~7表達(dá)量Fig. 2 Expression level of HaAPN1—7 in Cry1Ac-susceptible (A) and -resistant (B) strain

        2.4 敏感品系棉鈴蟲(chóng)取食不同Bt蛋白后中腸APN活性的變化

        取食Cry1Ac蛋白后,96S棉鈴蟲(chóng)中腸APN活性變化明顯(中腸酶液: F6,14=7.33,P=0.001;BBMV:F6,14=457,P<0.0001),與取食正常飼料的棉鈴蟲(chóng)相比,2 ng/larva(P=0.0009)、50 ng/larva(P=0.018)和0.25 μg/larva(P=0.003)劑量處理的棉鈴蟲(chóng)中腸酶液中APN活性顯著下降;所有不同Cry1Ac劑量處理的棉鈴蟲(chóng)中腸BBMV中APN活性與對(duì)照相比顯著下降(P<0.0001)。取食Cry2Ab蛋白后(F6,14=2.11,P=0.117),中腸酶液中APN活性無(wú)顯著變化(P>0.18);但與對(duì)照相比,所有劑量處理中腸BBMV中APN活性都顯著降低(F5,12=181,P<0.0001;1.25 μg/larva:P=0.029;其余劑量:P<0.0001)。取食Vip3Aa蛋白后,與對(duì)照相比,各個(gè)處理中腸酶液中APN活性顯著降低(F5,12=144,P<0.0001;所有劑量:P<0.0001);除了10 ng/larva劑量處理外,中腸BBMV中APN活性也都顯著降低(F5,12=117,P<0.0001;10 ng/larva:P=0.965;其余劑量:P<0.0001)(圖3)。

        圖3 取食不同Bt蛋白后敏感品系棉鈴蟲(chóng)中腸APN活性Fig. 3 APN activity in the midgut of Helicoverpa armigera susceptible larvae after fed different Bt proteins

        2.5 不同Bt抗性品系棉鈴蟲(chóng)中腸APN活性的比較

        與96S敏感品系棉鈴蟲(chóng)相比,各Bt抗性品系棉鈴蟲(chóng)中腸APN活性顯著降低(中腸酶液:F3,8=32.9,P<0.0001;BBMV:F3,8=21.3,P=0.0004),其中BtR品系(P=0.0004)和96S-Vip3Aa品系(P=0.004)棉鈴蟲(chóng)中腸酶液中APN活性顯著降低,96S-Cry2Ab品系與96S無(wú)顯著差異(P=0.564);而在BBMV中,與96S棉鈴蟲(chóng)相比,96S-Vip3Aa品系(P=0.0004)APN活性顯著降低,96S-Cry2Ab品系(P=0.056)和BtR品系與敏感品系差異不顯著(P=0.841)(圖4)。

        圖4 不同Bt抗性品系棉鈴蟲(chóng)中腸APN活性的差異Fig. 4 Differences of APN activity in the midgut of Helicoverpa armigera from different Bt resistant strains

        3 討論

        鱗翅目昆蟲(chóng)中腸APNs的分子量從100到180 kDa不等,具有多個(gè)保守區(qū)域,從蛋白的N端到C端依次為信號(hào)肽、蛋白前體區(qū)、GAMENWG基序、HEX2HX18E鋅指結(jié)構(gòu)基序、蘇氨酸富集區(qū)、糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphalidylinositol,GPI)錨定信號(hào)位點(diǎn)[28]。本研究克隆得到的HaAPN1~7都具有這些APN家族的共同特征。HaAPN1~7中,只有APN7沒(méi)有保守的GAMENWG基序和HEX2HX18E鋅指結(jié)構(gòu)基序,證明APN7不是一個(gè)有活性的氨肽酶N基因[12]。棉鈴蟲(chóng)APN4~7基因C末端沒(méi)有蘇氨酸富集區(qū),此區(qū)域也是APN的O-糖基化位點(diǎn);具有蘇氨酸富集區(qū)的APN1~3含有的O-糖基化位點(diǎn)的個(gè)數(shù)也不相同,HaAPN1和HaAPN2分別有39和31個(gè)O-糖基化位點(diǎn),HaAPN3有16個(gè)(表3)。相比于O-糖基化位點(diǎn),每個(gè)棉鈴蟲(chóng)的APN基因只有少數(shù)幾個(gè)N-糖基化位點(diǎn),其中HaAPN2無(wú)N-糖基化位點(diǎn)。APN的糖基化位點(diǎn)通常被認(rèn)為可能是Cry1Ac的結(jié)合區(qū)域[10,12],不同APN糖基化位點(diǎn)的差異可能是APNs與不同Bt蛋白結(jié)合存在差異的主要原因。例如,Cry1Ca蛋白與煙草天蛾106 kDa 的APN 結(jié)合、但不能和115 kDa大小的APN結(jié)合[29];歐洲玉米螟中APN1結(jié)合Cry1Ab和Cry1Fa,APN3a、APN8只結(jié)合Cry1Fa,APN2、APN3b,與Cry1Ab和Cry1Fa都不結(jié)合[30];棉鈴蟲(chóng)APN1~4均可以和Cry1Ac結(jié)合[12],其中APN1除了能與Cry1Ac結(jié)合外還能與Cry1Aa和Cry1Ab結(jié)合,APN2則只能與Cry1Ac結(jié)合[20,21,31]。因此,我們推測(cè)棉鈴蟲(chóng)APN1~6與不同的Bt可能存在不同的結(jié)合譜。

        Pigott and Ellar[10]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析后將鱗翅目序列劃分為5個(gè)類群,隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多昆蟲(chóng)的APN同工酶序列被克隆出來(lái),鱗翅目APNs又進(jìn)一步被細(xì)致地分為8個(gè)類群[4],在此基礎(chǔ)上Hughes[5]基于鱗翅目APNs的保守衍生基序,去掉Class7分支后加上雙翅目APNs,然后重新分析了鱗翅目APNs的系統(tǒng)發(fā)育情況[5]。本研究整合目前在NCBI上的鱗翅目APNs全長(zhǎng)序列,除去無(wú)信號(hào)肽和GPI錨定位點(diǎn)的PSA(puromycin-sensitive amino)類APN[4],進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為9個(gè)類群,Class 1~9。目前,不同類群APN均有作為Bt受體的報(bào)道,其中Class1~4類群APNs與Cry蛋白的相互作用研究較為廣泛,Class 1中煙草天蛾APN1[32]、小菜蛾P(guān)xAPN-A[33]、棉鈴蟲(chóng)APN1[20,31]、粉紋夜蛾APN1[34]已報(bào)道為Cry1Ac的受體;Class 2中煙草天蛾APN2可以與Cry1Ab5結(jié)合[7];Class 3中家蠶和小菜蛾APN3[35]、棉鈴蟲(chóng)APN3[3]、煙芽夜蛾120 kDa APN[37]、舞毒蛾APN1[38]可作為Cry1A的結(jié)合蛋白也有相關(guān)報(bào)道;Class 4中家蠶和小菜蛾的APN4可以與Cry1Aa、Cry1Ab結(jié)合[35]。Class 5~9類群作為Cry蛋白的受體報(bào)道還很少。

        為了明確APN在Bt殺蟲(chóng)或抗性機(jī)制中的作用,人們常用RNAi技術(shù)干擾APN的表達(dá)來(lái)明確其功能,如通過(guò)降低棉鈴蟲(chóng)、美國(guó)白蛾、甜菜夜蛾、二點(diǎn)委夜蛾Athetis lepigone等的APN基因表達(dá)量,證實(shí)了APN是Cry類蛋白的受體[39-42]。APN突變或表達(dá)量的改變與棉鈴蟲(chóng)[20]、甜菜夜蛾[43]、粉紋夜蛾[34]等對(duì)Cry1類蛋白的抗性相關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示棉鈴蟲(chóng)中腸APN1~7的表達(dá)量存在顯著差異,其中APN2的表達(dá)量最高,APN7的表達(dá)量最低;而且Cry1Ac抗性品系棉鈴蟲(chóng)中各類APN的表達(dá)趨勢(shì)與敏感品系一致。我們推測(cè),HaAPN1~7可能在分解蛋白、作為結(jié)合受體等方面有不同的重要性。

        Chougule等[44]曾報(bào)道,取食不同的飼料會(huì)造成棉鈴蟲(chóng)APNs表達(dá)量的差異;Cry1Ab抗性品系小蔗螟APN蛋白酶活性和表達(dá)量較敏感品系都顯著降低,敏感幼蟲(chóng)APN被RNAi后,APN活性降低、對(duì)Cry1Ab敏感性降低[45]。我們的研究結(jié)果顯示敏感品系棉鈴蟲(chóng)取食Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa蛋白后中腸APN活性顯著降低,其中取食Cry1Ac和Vip3Aa蛋白后中腸酶液中APN活性顯著降低,取食Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa蛋白后中腸BBMV上APN活性都顯著降低(圖3)。棉鈴蟲(chóng)對(duì)Cry1Ac、Cry2Ab和Vip3Aa產(chǎn)生耐受性后,中腸酶液和 BBMV中APN活性也發(fā)生了顯著變化,而且與96S棉鈴蟲(chóng)相比,BtR品系和96S-Vip3Aa品系棉鈴蟲(chóng)中腸酶液中APN活性顯著降低,96S-Vip3Aa品系棉鈴蟲(chóng)BBMV中APN活性顯著降低(圖4)。說(shuō)明棉鈴蟲(chóng)取食不同的Bt或?qū)Σ煌珺t有耐受性后,在中腸酶液中和BBMV上APN的活性變化不同。由此,我們推測(cè)棉鈴蟲(chóng)APN活性的變化與Bt蛋白的降解及抗性演化相關(guān),但具體的功能有待以后進(jìn)一步驗(yàn)證。

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