顏啟璋，陳海波，路 瑩，曹 勇，溫文勝，于大海

研究發(fā)現(xiàn)人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)與口咽癌尤其扁桃體鱗狀細(xì)胞癌(tonsil squamous cell carcinoma,TSCC)密切相關(guān)，且該種HPV相關(guān)性口咽癌有特殊的臨床生物學(xué)特點(diǎn)，如早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移但預(yù)后較好[1，2]。國(guó)外研究[2，3]顯示，這種口咽癌發(fā)生與性生活習(xí)慣有關(guān)，但隨著國(guó)內(nèi)外生活習(xí)慣的趨近，近來(lái)該疾病在國(guó)內(nèi)的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)是單層和柱狀上皮的標(biāo)志物，通常不表達(dá)于正常的鱗狀上皮細(xì)胞，而特異性地表達(dá)在子宮頸和口咽(扁桃體)組織上皮的交界處[4]。細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)在復(fù)層鱗狀上皮的基底細(xì)胞層中正常表達(dá)，目前被認(rèn)為是癌前病變和口腔鱗癌等癌癥的易感性標(biāo)志物[5，6]。CK7和CK19上調(diào)與HPV感染所致的宮頸癌和口咽癌密切相關(guān)[4，5]。p16INK4a蛋白(p16)是直接作用于細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞分裂的抑癌蛋白，p16蛋白在正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但在許多HPV相關(guān)的宮頸癌以及口咽癌中均高表達(dá)，為公認(rèn)的HPV感染替代標(biāo)志物[7～9]。研究[10]表明，在HPV相關(guān)性口咽癌中，HPV的致癌活性主要與E7蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)，而E7可結(jié)合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)抑癌蛋白并促進(jìn)其降解，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，p16蛋白大量表達(dá)。雖然目前對(duì)于CK7、CK19和p16在口咽癌致癌機(jī)制中的作用以及它們相互的時(shí)空影響及其表達(dá)規(guī)律尚不清楚，但有研究[11，12]認(rèn)為，在這個(gè)過(guò)程中CK7和CK19的參與起了重要的作用。關(guān)于三者在口咽癌中表達(dá)關(guān)系的研究仍較少，尤其是他們?cè)谙嗤课槐磉_(dá)關(guān)系的比較，以及癌組織、癌周隱窩上皮和表面上皮表達(dá)的比較更是鮮見(jiàn)報(bào)道。由于口咽包括扁桃體及軟腭等部位，為了減少混雜因素，本研究?jī)H選取腭扁桃體鱗狀細(xì)胞癌病例，通過(guò)連續(xù)石蠟切片，選取3～5個(gè)視野觀察比較CK7、CK19和p16在同一部位的表達(dá)關(guān)系，探討其與HPV相關(guān)性扁桃體癌變機(jī)制的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2015-07～2018-01廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科收治的17例TSCC患者的病歷資料及組織樣本，其中男12例，女5例；年齡39～77歲；漢族13例，壯族4例；病程1～48月。病理診斷分別為高分化鱗癌7例，中高分化鱗癌3例，中分化鱗癌5例，中低分化鱗癌1例，低分化鱗癌1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理標(biāo)本確診為腭扁桃體鱗狀細(xì)胞癌；(2)病案資料詳細(xì)完整；(3)具有完整的石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片的檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床診斷與術(shù)后病理不一致者；(2)合并多種慢性疾病者；(3)既往有TSCC及其他惡性腫瘤病史。石蠟標(biāo)本來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，每個(gè)病例的石蠟標(biāo)本取5 μm連續(xù)石蠟切片7～8張，可以在同一視野中比較CK7、CK19和p16的表達(dá)關(guān)系，能更好地反映表達(dá)的時(shí)空變化。

1.2主要試劑 一抗：p16(MAB-0673鼠單抗)、CK7(Kit-0021鼠單抗)和CK19(Kit-0030鼠單抗)的即用型抗體試劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。二抗：即用型快速免疫組化MaxVision HRP鼠/兔試劑盒(Kit-5010)購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。抗原修復(fù)液：Tris-EDTA抗原修復(fù)液(10×，pH=9.0；FD8804)購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司。DAB顯色液：DAB顯色試劑盒(20×；ZLI-9018)購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)公司。

1.3HE染色及免疫組化染色 所有標(biāo)本取4張連續(xù)石蠟切片進(jìn)行常規(guī)HE染色以及p16、CK7和CK19免疫組化染色。連續(xù)石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水后，采用Tris-EDTA行抗原修復(fù)，滴加3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，經(jīng)PBS緩沖液洗滌，先后滴加一抗及二抗孵育，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷 p16、CK7和CK19的陽(yáng)性染色是指組織切片中目標(biāo)細(xì)胞的胞核/胞質(zhì)見(jiàn)黃色或棕黃色著色，且無(wú)背景染色。通過(guò)染色細(xì)胞百分率測(cè)定CK7和CK19的免疫反應(yīng)性。陽(yáng)性細(xì)胞百分率分級(jí)[13]：陰性細(xì)胞(<1%)，以“-”示；斑片染色(1%～40%)，以“+”示；彌漫染色(>40%)，以“++”示。根據(jù)中國(guó)及美國(guó)的診斷規(guī)范[14，15]將p16免疫組織化學(xué)檢測(cè)示≥70%的腫瘤細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中等至強(qiáng)陽(yáng)性但未行HPV DNA/RNA檢測(cè)的鱗狀細(xì)胞癌定義為HPV相關(guān)性(p16+)鱗狀細(xì)胞癌，故本研究將p16染色細(xì)胞百分率分級(jí)定為：陰性細(xì)胞(<1%)，以“-”示；斑片染色(1%～70%)，以“+”示；彌漫染色(>70%)，以“++”示。本研究以p16呈彌漫染色(>70%)作為判定HPV相關(guān)性(p16+)TSCC的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(n)表示，采用Kappa一致性檢驗(yàn)分析p16、CK7和CK19檢測(cè)結(jié)果的一致性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.117例TSCC癌組織及癌周正常上皮CK7、CK19和p16的免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果 CK7、CK19、p16陽(yáng)性染色均見(jiàn)于鱗癌細(xì)胞胞質(zhì)。在11例CK7+中，僅1例呈彌漫染色(++)，10例呈斑片染色(+)。在15例CK19+中，有9例呈彌漫染色(++)，6例呈斑片染色(+)。在8例p16+中，有5例呈彌漫染色(++)，3例呈斑片染色(+)。除了CK7、CK19和p16三者同時(shí)陽(yáng)性的病例外，檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)了CK7-CK19+p16+的病例2例；未見(jiàn)單獨(dú)CK7+的病例，或者是CK7+和p16+而CK19-的病例，但有CK7+伴CK19+而p16-的病例。在p16強(qiáng)陽(yáng)性(++)的病例中，皆伴隨CK19強(qiáng)陽(yáng)性(++)。本研究的17例TSCC患者共有5例為HPV相關(guān)性(p16+)鱗狀細(xì)胞癌，另12例為非HPV相關(guān)性鱗狀細(xì)胞癌。見(jiàn)表1，圖1，2。

2.2HPV相關(guān)性(p16+)TSCC組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果 由于HPV相關(guān)性(p16+)TSCC樣本量較小(5例)，故分析選取了20個(gè)視野(每個(gè)樣本選4個(gè)視野)進(jìn)行分析。Kappa一致性分析結(jié)果顯示，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測(cè)結(jié)果均具有一致性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 17例TSCC癌組織及癌周正常上皮CK7、CK19和p16的免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果

?HE染色；?免疫組化染色見(jiàn)CK7在癌組織中尤其是癌巢內(nèi)表面呈彌漫染色(++，黑箭頭示)，在隱窩上皮呈陰性(白箭頭示)；?免疫組化染色見(jiàn)CK19在癌組織(黑箭頭示)和隱窩上皮(白箭頭所示)均呈彌漫染色(++)；?免疫組化染色見(jiàn)p16在癌組織(黑箭頭所示)和隱窩上皮(白箭頭所示)均呈彌漫染色(++)

?HE染色；?免疫組化染色見(jiàn)CK7主要表達(dá)于上皮表層，呈斑片染色(+，黑箭頭示)；?免疫組化染色見(jiàn)CK19主要表達(dá)于上皮下層和基底細(xì)胞，呈斑片染色(+，黑箭頭示)；?免疫組化染色見(jiàn)p16主要表達(dá)于上皮下1/3至全層，呈斑片染色(+),與CK19部位基本重疊(黑箭頭示)

表2 HPV相關(guān)性(p16+)TSCC組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果(n)

2.3非HPV相關(guān)性TSCC組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果 對(duì)于非HPV相關(guān)性TSCC組織，Kappa一致性分析結(jié)果顯示，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測(cè)結(jié)果不具一致性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 非HPV相關(guān)性TSCC組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果(n)

2.417例TSCC癌周表面上皮組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果 對(duì)于TSCC癌周表面上皮組織，Kappa一致性分析結(jié)果顯示，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測(cè)結(jié)果均具有一致性(P<0.05)，其中以CK19與p16的檢測(cè)結(jié)果一致性最強(qiáng)。見(jiàn)表4。

表4 17例TSCC癌周表面上皮組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果(n)

2.517例TSCC癌周隱窩上皮組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果 對(duì)于TSCC癌周隱窩上皮組織，CK7與CK19、CK7與p16以及CK19與p16的檢測(cè)結(jié)果均具有一致性(P<0.05)，且一致性均較強(qiáng)。見(jiàn)表5。

表5 17例TSCC癌周隱窩上皮組織CK7、CK19、p16檢測(cè)結(jié)果的Kappa一致性分析結(jié)果(n)

3 討論

3.1E7是HPV相關(guān)口咽癌的主導(dǎo)性癌蛋白，CK7氨基酸91-96序列中的SEQIKA片段可與E7 mRNA結(jié)合，防止其降解，在角蛋白家族中只有CK7和E7有這種特異性的反應(yīng)。而CK7特異性地表達(dá)于連接部位，如宮頸連接處上皮及扁桃體隱窩上皮。HPV感染機(jī)體后CK7可與E7 mRNA結(jié)合并鎖定其轉(zhuǎn)錄，而CK19作為CK7的異源二聚體，通過(guò)與CK7 SEQIKA片段結(jié)合，解除鎖定并促進(jìn)E7 mRNA翻譯成癌蛋白[4，11，12，16]。E7與Rb抑癌蛋白結(jié)合并使之被降解，而Rb抑癌蛋白的失活解除了對(duì)p16轉(zhuǎn)錄的抑制，造成p16過(guò)度表達(dá)[10]。在HPV感染過(guò)程中，CK7和CK19調(diào)控E7、p16的表達(dá)機(jī)制仍未明確，認(rèn)為CK7和CK19在參與調(diào)控E7的過(guò)程，可能存在一種“CK7→CK19→p16軸”的關(guān)系，但其是否存在嚴(yán)格的時(shí)間順序在臨床病理研究中尚未得到闡釋。

3.2本研究通過(guò)連續(xù)切片研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在癌組織還是在癌周正常上皮中，除了CK7+CK19+p16+以外，還存在CK7+CK19+p16-或CK7-CK19+p16+的情況，但未出現(xiàn)CK7+CK19-p16+的情況。且統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，在癌周正常上皮和癌組織中，CK7、CK19和p16具有關(guān)聯(lián)性，提示可能存在“CK7→CK19→p16軸”的調(diào)控機(jī)制。本研究結(jié)果中的CK7+CK19+p16-可能是由于CK7與CK19的配對(duì)屬性造成的[13]，故二者能同時(shí)表達(dá)，而p16-說(shuō)明該例TSCC可能并不是由HPV感染引起的癌變。另一方面，Huang等[17]發(fā)現(xiàn)，在宮頸上皮低度惡性病變中，CK7的表達(dá)是向惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，而p16的表達(dá)與之無(wú)關(guān)。另外，Hashiguchi等[18]發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中，隨著病情的進(jìn)展，CK7的表達(dá)消失可預(yù)示宮頸癌的進(jìn)展及預(yù)后不良。Woods等[4]發(fā)現(xiàn)在扁桃體隱窩上皮CK7特異性強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而扁桃體癌中也發(fā)現(xiàn)CK7-和p16+的現(xiàn)象，認(rèn)為是因?yàn)镃K7隨著腫瘤進(jìn)展和細(xì)胞分化而失去表達(dá)。Lee等[13]在宮頸癌變過(guò)程中的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著癌變進(jìn)展，CK7在癌前病變階段高表達(dá)，且隨著癌變進(jìn)展，在癌時(shí)卻有近1/3的病例呈CK7-CK19+p16+的情況。說(shuō)明CK7的表達(dá)可能是HPV感染的一個(gè)“早期事件”和先決條件，隨著病情的進(jìn)展，CK7表達(dá)會(huì)逐漸消退，而p16的表達(dá)與CK19密切相關(guān)，是在HPV感染致癌過(guò)程中出現(xiàn)的“后期事件”。其中CK19可能起到了承上啟下的重要作用。

3.3本研究發(fā)現(xiàn)，在TSCC癌周正常表面上皮及隱窩上皮均有CK7、CK19及p16的表達(dá)。CK7主要表達(dá)于上皮表層，CK19主要表達(dá)于上皮下層及基底部，而p16主要在上皮的下1/3至全層表達(dá)，與CK19部位基本重疊。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果也顯示，在癌周正常上皮中，CK7、CK19和p16具有關(guān)聯(lián)性，且CK19和p16的表達(dá)具有顯著一致性。Lee等[13]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在宮頸上皮內(nèi)瘤變時(shí)，可觀察到上皮表層CK7和基底CK19的同時(shí)表達(dá)，隨著惡變的進(jìn)展，CK7逐漸向下層擴(kuò)展；而CK19的表達(dá)逐漸向上，且伴p16的表達(dá)，部位與之重疊，認(rèn)為這是由于受到不同或復(fù)合的高危HPV感染，上皮表層來(lái)自鱗狀-柱狀上皮交界處的CK7+細(xì)胞和下層CK19+基底干細(xì)胞同時(shí)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化。而Woods等[4]發(fā)現(xiàn)，CK7表達(dá)于正常扁桃體以及TSCC癌周的隱窩上皮表層，但在表面上皮中未見(jiàn)表達(dá)，認(rèn)為HPV感染引起的癌變應(yīng)該來(lái)源于隱窩上皮而且是上皮表層，而不是深層。因此推測(cè)CK7需要CK19的參與才會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致p16的表達(dá)。雖然本研究還發(fā)現(xiàn)了CK7、CK19和p16同時(shí)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的病例，但這種強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)可能正處于癌癥內(nèi)表達(dá)達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)，隨后CK7逐漸消退。因此我們?nèi)匀徽J(rèn)為CK7的表達(dá)需要CK19的參與才會(huì)引起癌變，如果沒(méi)有CK19對(duì)E7 mRNA翻譯的促進(jìn)作用，CK7將無(wú)法引起p16的表達(dá)。

3.4另外，Klingenberg等[19]在262例非腫瘤扁桃體組織的研究發(fā)現(xiàn)，扁桃體隱窩以及表面上皮全部為p16-。而本研究針對(duì)扁桃體癌不僅在隱窩上皮中觀察到了類似的情況，也觀察到癌周的扁桃體表面上皮也有相似的表達(dá)，這說(shuō)明在扁桃體受HPV感染引起癌變的情況下，可能表面上皮逆向地受到了癌組織HPV感染，這也符合高危型HPV可以感染暴露的基底細(xì)胞向鱗狀上皮分化后向上分裂和遷移的觀點(diǎn)[13]，或者癌組織的CK19和p16的表達(dá)可以反向誘導(dǎo)上皮表達(dá)CK19和p16。此外，由于CK7可表達(dá)于多種有分泌能力的細(xì)胞，因此，在上皮表層以及癌巢內(nèi)表面的CK7陽(yáng)性細(xì)胞還具有分泌釋放病毒的能力，有助于感染播散，而其表達(dá)降低則抑制了這種能力，這也許是機(jī)體組織的一種防御機(jī)制[13]。

3.5本研究還存在一些不足之處，雖然本課題組對(duì)所有樣本均進(jìn)行了HPV-DNA的原位雜交檢測(cè)，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為HPV-DNA陰性，這可能與HPV-DNA原位雜交的敏感度較低有關(guān)，這與臨床上采用相同的方法所得的結(jié)果相類似[20]，當(dāng)然也可能與實(shí)驗(yàn)操作中的疏忽或樣本量較少有一定關(guān)系。由于p16的過(guò)表達(dá)在HPV驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的存活中發(fā)揮重要作用，從而突出了p16免疫組化染色作為HPV陽(yáng)性的替代指標(biāo)的適用性[20]。因此本研究參照國(guó)內(nèi)外的診斷規(guī)范采用p16作為HPV感染的替代標(biāo)志物[14，15]。

綜上所述，CK7、CK19和p16在HPV相關(guān)性(p16+)TSCC中的表達(dá)可能存在“CK7→CK19→p16軸”的調(diào)控機(jī)制。但是，在這個(gè)過(guò)程中，CK7和CK19所起的作用仍未明確，例如CK7表達(dá)消退是癌變進(jìn)展的必需，還是僅為癌變的后果；CK7在隱窩上皮的特異表達(dá)，是不是HPV感染導(dǎo)致癌變所必需，在其他CK7不表達(dá)的部位是否就不會(huì)發(fā)生癌變；或者是否還有其他因子也可引起CK19發(fā)生類似的調(diào)控機(jī)制，這還需開(kāi)展體內(nèi)外試驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。