薛經(jīng)緯，陶智會(huì)，李 勇，朱 毅

(1. 上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海 201800；2. 上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)屬于一種可防可治的疾病，常由于長(zhǎng)期暴露于有害顆?；驓怏w使氣道和/或肺泡異常所致。該病的主要特點(diǎn)是氣流受限與呼吸道癥狀，同時(shí)具有病情遷延不愈、癥狀常年存在及易反復(fù)發(fā)作等特征。目前，COPD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為與氣道與肺部的慢性炎癥、氧化抗氧化系統(tǒng)失衡、支氣管及肺泡上皮細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)。雖然現(xiàn)階段針對(duì)COPD采取的治療措施可以改善患者臨床癥狀，但無(wú)法有效抑制病情進(jìn)展，所以進(jìn)一步明確COPD病機(jī)非常重要。方邦江教授通過(guò)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐認(rèn)為“痰濁壅肺證”是COPD的主要證型之一，治療上應(yīng)以理肺、化痰、祛瘀立法，辨證論治，盡可能祛除外邪，改善癥狀，防止病情加重，使患者快速進(jìn)入穩(wěn)定期，故而創(chuàng)立了由瓜蔞薤白半夏湯、二陳湯、三拗湯組成的寬胸理肺湯，臨床應(yīng)用療效確切。而三子養(yǎng)親湯是醫(yī)治氣滯痰壅的經(jīng)典名方，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。課題組前期臨床研究結(jié)果表明，寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯治療COPD急性加重期痰濁壅肺證患者，能有效抑制全身炎癥反應(yīng),降低白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及血清炎癥因子水平，改善肺功能和臨床癥狀體征[1-2]。為進(jìn)一步證實(shí)寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯的有效性及探討其作用機(jī)制，本課題組采用煙熏加氣管注內(nèi)毒素法誘導(dǎo)的COPD大鼠模型進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)Wistar大鼠42只，體重180～220 g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào)：2018000529121。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，(25±2)℃恒濕，人工光照12 h、黑暗12 h，自由進(jìn)食飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及制備 寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯藥物組成：麻黃9 g、杏仁12 g、全瓜蔞30 g、薤白12 g、半夏10 g、橘紅6 g、茯苓15 g、甘草6 g、桃仁10 g、地龍9 g、蘇子10 g、萊菔子10 g、白芥子10 g。用自動(dòng)煎藥機(jī)煎煮成200 mL湯藥，濃縮4倍，按實(shí)驗(yàn)所需濃度稀釋。

1.3主要試劑和儀器 Bax、Bcl-2抗體(Santa Cruz公司)， Caspase-3、Caspase-9抗體(Abcam公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠、兔IgG(cell signaling technology公司)，β-actin抗體(cell signaling technology公司)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)、 白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD) ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司，內(nèi)毒素(LPS)購(gòu)自Sigma公司。Neofuge 15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal force公司)，Var10skan Flash熒光酶標(biāo)儀(Thermo scientific公司)，Wellwash 4 mk 2型洗板機(jī)(Labsystems dragon公司)，JX-FSTPRP-48型電動(dòng)勻漿機(jī)(上海凈信公司)， 微型垂直電泳、電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、ChemiDocTM XRS+ 自動(dòng)顯影系統(tǒng)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 取7只健康雄性Wistar大鼠作為正常組，每天正常呼吸新鮮空氣，于實(shí)驗(yàn)第1天及第14天時(shí)麻醉大鼠后給予生理鹽水氣管內(nèi)滴注；余35只大鼠參考文獻(xiàn)[3]，采用煙熏加氣管滴注LPS法制備COPD模型：在染毒箱內(nèi)被動(dòng)吸煙12支/(次·d)，染毒時(shí)間為30 min，其余時(shí)間呼吸新鮮空氣，在實(shí)驗(yàn)第1天及第14天時(shí)麻醉大鼠后在氣管內(nèi)滴注200 μL LPS水溶液(1 mg/mL)，滴注過(guò)程需緩慢，滴注日不進(jìn)行染毒操作。連續(xù)煙熏28 d后，驗(yàn)證模型制備成功。將建模成功大鼠隨機(jī)分成COPD組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、乙酰半胱氨酸組，每組7只。中藥高、中、低劑量組分別按照5，2.5，1.25 g生藥/kg的劑量(為臨床用藥的2，1，0.5倍)給予寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯灌胃，乙酰半胱氨酸組給予乙酰半胱氨酸0.8 g/kg(為臨床用藥的1倍)灌胃，藥物均用0.5%羧甲基纖維素鈉配制；正常組和COPD組分別給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃；均1次/d，持續(xù)28 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1血清炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo) 各組大鼠在末次灌胃后24 h，用10 mg/mL的戊巴比妥鈉麻醉后，解剖開(kāi)胸經(jīng)心臟采集血液，常溫下以3 500 r/min的速度進(jìn)行離心，10 min后取血清放至EP管中，隨后保存在-20 ℃冰箱,采用ELISA法檢測(cè)血清IL-6、 IL-8、TNF-α、MDA、SOD水平。

1.5.2肺組織病理組織學(xué)觀察 取部分大鼠肺組織，放置于4%多聚甲醛液中進(jìn)行組織固定，梯度濃度酒精逐步脫水，用石蠟包埋組織，4～7 μm切片，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5.3肺組織中凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[4],采用Western blot法檢測(cè)：取用錫紙包裹后放至-80 ℃冰箱保存的部分肺組織，加入RIPA裂解液，隨后經(jīng)組織均漿、超聲裂解、低溫高速離心、抽取上清等操作提取組織蛋白，經(jīng)過(guò)BCA蛋白定量后按調(diào)定的蛋白比例加入5×上樣緩沖液，煮沸變性待測(cè)。將蛋白樣本經(jīng)凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜上，隨后進(jìn)行封閉、洗滌、一抗孵育(2%BSA稀釋至1∶500～1∶1 000)、洗滌、二抗孵育(5%脫脂奶粉稀釋至1∶1 000～1∶2 000)、洗滌、顯影等操作，最后使用ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白半定量分析，用目的蛋白/內(nèi)參蛋白的光密度值比率來(lái)表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，采用Graphpad 9.0軟件制成柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1各種大鼠血清炎癥因子IL-6、 IL-8、TNF-α水平比較 COPD組大鼠血清IL-6、 IL-8、TNF-α水平均顯著高于正常組(P均<0.05)，中藥各組及乙酰半胱氨酸組大鼠血清IL-6、 IL-8、TNF-α水平均顯著低于COPD組(P均<0.05)；中藥高劑量組大鼠血清IL-6、IL-8水平明顯低于乙酰半胱氨酸組(P均<0.05),TNF-α水平明顯高于乙酰半胱氨酸組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清IL-6、 IL-8、TNF-α水平比較

2.2各組大鼠血清SOD、MDA水平比較 COPD組大鼠血清MDA水平顯著高于正常組(P<0.05)，SOD水平顯著低于正常組(P<0.05)；中藥各組及乙酰半胱氨酸組大鼠血清MDA水平顯著低于COPD組(P均<0.05)，血清SOD水平顯著高于COPD組(P均<0.05)；中藥高劑量組血清MDA水平顯著低于乙酰半胱氨酸組(P<0.05)，血清SOD水平顯著高于乙酰半胱氨酸組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較

2.3各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組大鼠支氣管管腔通暢，上皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)杯狀細(xì)胞增生，未見(jiàn)上皮細(xì)胞鱗狀化生，管腔及周?chē)芪匆?jiàn)炎性細(xì)胞聚集浸潤(rùn)；COPD組大鼠小氣道管腔明顯狹窄，結(jié)締組織增生，支氣管管壁增厚，黏液細(xì)胞增多，部分可見(jiàn)黏液堵塞氣道，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞不同程度皺縮破壞，管腔及周?chē)芸梢?jiàn)中性粒細(xì)胞聚集；與模型組比較，中藥各組及乙酰半胱氨酸組大鼠氣道上皮細(xì)胞脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增多以及肺氣腫形成等現(xiàn)象均有不同程度減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色病理學(xué)表現(xiàn)(×100)

2.4各組大鼠肺組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較COPD組大鼠肺組織中Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)量均顯著高于正常組(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)；中藥各組及乙酰半胱氨酸組大鼠肺組織中Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)量均顯著低于COPD組(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著高于COPD組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討 論

COPD屬于一種可防可治的疾病，其具有異質(zhì)性，早期有效干預(yù)能夠延緩病情發(fā)展，改善預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示，40歲以上人群COPD的患病率已達(dá)13.7%，60歲以上人群患病率高達(dá)27%，相較于2007年升高近1倍，而目前我國(guó)COPD致死致殘人數(shù)約占全球的30%[5]。COPD的病因多樣，一般認(rèn)為與吸煙、粉塵接觸、大氣污染、家族遺傳、性別及年齡、肺生長(zhǎng)發(fā)育異常等相關(guān)。隨著研究的深入，學(xué)者們對(duì)COPD的發(fā)病機(jī)制提出了氧化應(yīng)激、氣道重塑以及氣道炎癥等多種假說(shuō)。 巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分泌的增多與COPD的炎癥具有直接的關(guān)聯(lián)，此類(lèi)炎性細(xì)胞可分泌炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子，通過(guò)氧化應(yīng)激等機(jī)制激活，損傷氣道，破壞肺實(shí)質(zhì)，使氣道重塑，從而引發(fā)氣流受限。COPD形成、發(fā)展的核心是氣道炎癥，氣道炎癥和氣流受限、肺氣腫、肺功能惡化等密切相關(guān)，炎癥加重可使病情惡化[6-7]，同時(shí)也會(huì)影響COPD急性加重的頻率[8]，因此抑制炎癥反應(yīng)是COPD治療的核心。TNF-α的生物作用有兩種，其屬于一種免疫防護(hù)介質(zhì)，可以保護(hù)機(jī)體，但如其表達(dá)異常也會(huì)損傷機(jī)體免疫，導(dǎo)致 NF-κB激活，使機(jī)體反復(fù)出現(xiàn)氣道炎癥[9]。王慧敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞被激活后分泌大量的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8 等，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，損傷支氣管、肺組織。而在炎癥刺激作用下，細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈中斷，會(huì)產(chǎn)生大量活性氧自由基，過(guò)量活性氧自由基會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，增加細(xì)胞膜的通透性并使其流動(dòng)性降低，會(huì)導(dǎo)致鈣離子大量?jī)?nèi)流，進(jìn)一步促使活性氧自由基產(chǎn)生[11]，這種狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道持續(xù)開(kāi)放，使線粒體膜電位喪失，釋放細(xì)胞色素C并與凋亡蛋白酶活化因子-1相結(jié)合形成多聚體，促使Caspase-9與其結(jié)合成為凋亡小體，發(fā)生Caspase蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12-14]。此外，Bcl-2與Bax的平衡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[15]。目前研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡在COPD發(fā)病過(guò)程中有重要作用[16]，但COPD細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)及其機(jī)制尚不十分清楚。

圖2 各組大鼠肺組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)情況

COPD在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中并無(wú)專(zhuān)屬病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)、相關(guān)癥狀體征及病情進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，大部分醫(yī)家將其辨病為“咳嗽”“喘證”“肺脹”等。COPD多是由肺部疾病日久遷延不愈所致，故“肺脹”病名與其契合度最高。目前大多醫(yī)家認(rèn)為肺脹病因病機(jī)在于先有肺虛，之后邪實(shí)閉肺而喘,為本虛標(biāo)實(shí)之病，也提示本病的形成和發(fā)展不但與正虛相關(guān),而且和外邪的反復(fù)侵襲有關(guān)，由于外邪入里而產(chǎn)生內(nèi)外合邪，形成正虛邪戀,最終導(dǎo)致病情加重。此外在COPD發(fā)展的不同階段，病機(jī)特點(diǎn)有所側(cè)重，早期以肺虛為主，病情進(jìn)一步發(fā)展,久病累及脾、腎，COPD不斷反復(fù)的關(guān)鍵內(nèi)因?yàn)榉纹⒛I虛。故認(rèn)為本虛標(biāo)實(shí)是COPD的基本病機(jī)，本虛多涉及肺脾腎等臟腑，標(biāo)實(shí)多與痰、瘀、六淫外邪等有關(guān)。寬胸理肺湯由瓜蔞薤白半夏湯合二陳湯、三拗湯化裁而成，瓜蔞薤白半夏湯可以通陽(yáng)散結(jié)，行氣解郁，化痰寬胸，此處用其滌痰行水之功，對(duì)于痰濕水飲壅滯于肺臟，肺氣失于宣降所導(dǎo)致的咳嗽咳痰、氣促有較好的療效；二陳湯燥濕化痰，三拗湯止咳平喘，聯(lián)合三子養(yǎng)親湯共同發(fā)揮鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥各組及乙酰半胱氨酸組血清IL-6、 IL-8、TNF-α、MDA水平及肺組織中Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)量均顯著低于COPD組，血清SOD水平及肺組織中Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著高于COPD組；HE染色示氣道上皮細(xì)胞脫落、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增多以及肺氣腫形成等現(xiàn)象均有不同程度減輕。提示寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯能抑制COPD大鼠血清炎癥因子分泌，對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制支氣管及肺泡上皮細(xì)胞凋亡，阻止病情進(jìn)展。本研究為寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯用于臨床治療COPD提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。