孟東雪 郭玉榮 羅斌軍 周新華 傅堯 曹天雄

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的 80%［1?3］。目前，盡管 NSCLC 的治療取得了很大進(jìn)展，但患者的臨床生存率仍然很低［4］。因此，尋找有效的治療藥物及靶點(diǎn)迫在眉睫。

傳統(tǒng)中藥用于治療惡性腫瘤歷史悠久，也是化學(xué)抗癌藥物和多種化療藥物的重要來(lái)源［5?6］。扶正抑瘤湯是由三棱（10 g）、莪術(shù)（15 g）、龍葵（15 g）、白英（10 g）、半枝蓮（30 g）、白花蛇舌草（30 g）、黃芪（9 g）、當(dāng)歸（30 g）、茯苓（30 g）、白術(shù)（10 g）等10種中草藥按一定比例混合而成的經(jīng)典方劑［7］。目前研究表明扶正抑瘤湯能抑制前列腺癌、肝癌生長(zhǎng)［8?9］。然而，扶正抑瘤湯對(duì)NSCLC的影響及其機(jī)制尚不清楚。越來(lái)越多證據(jù)表明，凋亡通路失調(diào)可促進(jìn)腫瘤發(fā)生［10?11］。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與NSCLC細(xì)胞凋亡過(guò)程［12］，失活的 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路可以抑制NSCLC細(xì)胞存活，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡［13］。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，涉及許多生理和病理過(guò)程，有助于維護(hù)基因組完整性［14］。本研究探討扶正抑瘤湯對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響及其是否通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路影響NSCLC的生物學(xué)行為，旨在為扶正抑瘤湯治療NSCLC提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所；扶正抑瘤湯中藥購(gòu)自桂林市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥房；CCK?8試劑盒購(gòu)自默沙克有限公司；胎牛血清購(gòu)自 Gibco公司；一抗 Beclin?1、LC3B、P62、PI3K、p?PI3K、Akt、p?Akt、mTOR以及p?mTOR均購(gòu)自英國(guó)Abcam（上海）公司；β?actin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)自英國(guó)Abcam（上海）公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)自美國(guó)Becton公司；Annexin V?APC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bioswamp公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

A549細(xì)胞用含DMEM和10% FBS培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)用胰蛋白酶消化后傳代。將A549細(xì)胞置于96孔板（1×104/孔）中，孵育 6 h，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度（12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL、400 mg/mL）扶正抑瘤湯處理A549細(xì)胞，陰性對(duì)照組為培養(yǎng)基培養(yǎng)的A549細(xì)胞，空白對(duì)照組為150 μL DMSO。

1.3 藥物的制備與處理

扶正抑瘤湯采用常規(guī)方法煎制和濃縮。用乙醇沉淀后在高速離心機(jī)中去除沉淀雜質(zhì)；用PBS溶解提取物，并采用0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，合并濾液、減壓濃縮成1 g/mL的藥液，貯存于4℃以下冰箱中備用。

1.4 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

將A549細(xì)胞接種至96孔板（1×104/孔）中，并置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度扶正抑瘤湯處理A549細(xì)胞，繼續(xù)孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK?8溶液，37 ℃下孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率（%）=［（對(duì)照組OD值?實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值］×100%。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將對(duì)照組、DMSO組和200 mg/mL扶正抑瘤湯處理后的A549細(xì)胞用含8% FBS的培養(yǎng)液配制成密度為3×105/mL的細(xì)胞懸液后，加入預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室上室，下室加入含有20% FBS的培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h。取出Transwell小室，經(jīng)甲醛固定、1%結(jié)晶紫染色、PBS漂洗后，用棉簽拭去殘留細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將對(duì)照組、DMSO組和200 mg/mL扶正抑瘤湯處理后的A549細(xì)胞分別接種于6孔板（6×103/孔）中培養(yǎng)，待細(xì)胞的融合度達(dá)75%以上時(shí)，用200 μL的移液管尖垂直皿底橫線(xiàn)做劃線(xiàn)，PBS洗去脫落細(xì)胞，無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h和24 h用倒置顯微鏡拍攝劃痕區(qū)，Image J軟件測(cè)量劃痕邊緣之間的距離來(lái)量化偏移率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用相機(jī)拍照。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

將對(duì)照組、DMSO組和200 mg/mL扶正抑瘤湯處理后的A549細(xì)胞接種于6孔板（5×105/孔）中培養(yǎng)，按照Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的操作步驟，各組細(xì)胞經(jīng)PBS溶液洗滌后，分別加入5 μL Annexin V和10 μL PI，再加入400 μL 稀釋液混勻。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測(cè)自噬和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

收集培養(yǎng)24 h后的各組A549細(xì)胞，用RIPA裂解緩沖液冰上裂解10 min后，提取細(xì)胞總蛋白。采用增強(qiáng)型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。12% SDS?PAGE分離40 μg的總蛋白樣本并轉(zhuǎn)至PVDF?膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h后，加入Beclin?1、LC3B、P62、PI3K、p?PI3K、Akt、mTOR和β?catin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；加入與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二級(jí)抗體（1∶3 000；Santa Cruz），室溫孵育1 h，加入ECL顯影，Bio?Rad 全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image?ProPlus分析光密度。以β?actin為內(nèi)參，計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬體的形成情況

將A549細(xì)胞接種于6孔板（6×103/孔）中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到75%以上時(shí)，收集細(xì)胞。PBS清洗，戊二醛固定2 h；再用PBS清洗2次，經(jīng)濃度梯度分別為50%、70%、80%、90%、100%的乙醇和100%丙酮依次脫水15 min，Epon 812包埋和超薄切片后，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色并置于透射電鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶正抑瘤湯對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

CCK?8檢測(cè)結(jié)果顯示，A549細(xì)胞增殖抑制率呈濃度依賴(lài)性上升，不同濃度扶正抑瘤湯作用的細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.227，P＜0.001），且扶正抑瘤湯濃度為200 mg/mL、400 mg/mL時(shí)細(xì)胞增殖抑制率高于0 mg/mL組（P=0.019；P＜0.001），見(jiàn)圖1。本研究選擇200 mg/mL扶正抑瘤湯進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度扶正抑瘤湯對(duì)NSCLC細(xì)胞A549增殖的影響Fig.1 Effects of Fuzheng Yiliu decoction with different concentra‐tions on the proliferation of NSCLC cell A549

2.2 扶正抑瘤湯對(duì)A549細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡的影響

200 mg/mL扶正抑瘤湯處理后，對(duì)照組、DMSO組和扶正抑瘤湯組A549細(xì)胞侵襲數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.423，P＜0.001），其中扶正抑瘤湯組細(xì)胞侵襲數(shù)低于對(duì)照組（P=0.004），見(jiàn)圖2A～B。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A549細(xì)胞遷移率在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.118，P=0.014），扶正抑瘤湯組細(xì)胞遷移率低于對(duì)照組（P=0.027），見(jiàn)圖2C～D。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，A549細(xì)胞凋亡率在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.707，P＜0.001），扶正抑瘤湯組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P=0.001），見(jiàn)圖2E～F。

2.3 扶正抑瘤湯對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)扶正抑瘤湯處理后，各組細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)分子Beclin?1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組相比，扶正抑瘤湯處理組Beclin?1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P=0.043；P=0.041），P62蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P=0.028），見(jiàn)圖3A～B。24 h后，透射電鏡下觀察到扶正抑瘤湯處理組細(xì)胞包漿內(nèi)可見(jiàn)大量自噬溶酶體形成，DMSO組偶見(jiàn)少量自噬體形成，而對(duì)照組無(wú)明顯自噬體形成，見(jiàn)圖3C。

圖3 扶正抑瘤湯對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及自噬體形成的影響Fig.3 Effects of Fuzheng Yiliu decoction on autophagy related pro‐tein expression and autophagosome formation in A549 cells

2.4 扶正抑瘤湯對(duì)A549細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)扶正抑瘤湯處理后，A549細(xì)胞內(nèi)PI3K、Akt、mTOR總蛋白水平在各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），細(xì)胞內(nèi)p?PI3K、p?Akt、p?mTOR總蛋白水平在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且磷酸化比值 p?PI3K/PI3K、p?Akt/Akt、p?mTOR/mTOR水平在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組相比，扶正抑瘤湯處理組的磷酸化蛋白p?PI3K、p?Akt、p?mTOR均下調(diào)（P=0.003，0.028，0.004），其磷酸化比值 p?PI3K/PI3K、p?Akt/Akt、p?mTOR/mTOR降低（P=0.021，0.011，0.016），見(jiàn)圖4。

圖4 扶正抑瘤湯對(duì)A549細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Fuzheng Yiliu decoction on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related protein expression in A549 cells

3 討論

目前盡管NSCLC治療取得較大進(jìn)展，但臨床生存率仍很低。因此，尋找有效的NSCLC治療靶點(diǎn)迫在眉睫。中藥具有多種生物活性成分，能發(fā)揮良好的抗癌作用，被用于治療包括癌癥在內(nèi)的多種疾病。在NSCLC治療中也已有較多報(bào)道，例如，有研究報(bào)道中藥溫下腸腑方能抑制A549細(xì)胞系體外增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，還能有效抑制化療引起的免疫器官萎縮［15］。扶正抗癌方能有效抑制肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移進(jìn)而逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程［16］。也有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)肺湯能抑制NSCLC發(fā)生和發(fā)展［17］。本研究采用不同濃度扶正抑瘤湯處理A549細(xì)胞，CCK?8結(jié)果表明，在扶正抑瘤湯抑制A549細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴(lài)性。另外，Transwell小室侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)表明扶正抑瘤湯能抑制A549細(xì)胞侵襲和遷移。同時(shí)，流式細(xì)胞儀研究結(jié)果還顯示扶正抑瘤湯處理細(xì)胞凋亡率明顯升高。這些結(jié)果說(shuō)明扶正抑瘤湯具有抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞自噬是一種被激活的程序性細(xì)胞死亡，通過(guò)消除細(xì)胞異常增殖以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，被認(rèn)為是癌癥治療的靶點(diǎn)［18］。自噬由多種信號(hào)通路（如PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路）和細(xì)胞應(yīng)激（如營(yíng)養(yǎng)剝奪、缺氧或代謝應(yīng)激）觸發(fā)，但目前對(duì)基礎(chǔ)自噬和刺激自噬的區(qū)別知之甚少。在癌癥晚期，自噬正性增強(qiáng)，并通過(guò)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［19］。自噬的啟動(dòng)一般始于ULK1激活，在自噬發(fā)生過(guò)程中，LC3Ⅰ與脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合形成LC3Ⅱ，最終被招募到細(xì)胞膜上，其蛋白表達(dá)水平和自噬溶酶體數(shù)量呈正相關(guān)。這種脂偶聯(lián)形式的LC3作為自噬小體標(biāo)記已被確立［20］。最終，自噬體的內(nèi)容物被降解為大分子前體，自噬體與溶酶體融合后被循環(huán)利用或?yàn)榇x途徑提供燃料。在此過(guò)程中，LC3通過(guò)P62降解測(cè)定自噬通量，該蛋白與其他作為自噬體和LC3Ⅱ重要底物的蛋白一起降解［20］。本研究采用扶正抑瘤湯處理A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)可上調(diào)Beclin?1蛋白表達(dá)，LC3Ⅱ/Ⅰ比值上升，且P62下調(diào)，自噬溶酶體數(shù)量增加，這些自噬相關(guān)蛋白及自噬溶酶體的變化表明扶正抑瘤湯能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬。

P13K/Akt/mTOR信號(hào)通路是目前腫瘤發(fā)生發(fā)展研究的熱點(diǎn)之一，在肺癌組織中活化表達(dá)，已成為肺癌的治療靶點(diǎn)之一［21］。有研究報(bào)道，在酵母［22］、果蠅［23］和哺乳動(dòng)物細(xì)胞［24］中，mTOR作為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游成分，對(duì)自噬發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。正常情況下，磷酸化的PI3K磷酸化Akt，然后激活mTOR［25］，隨后，mTOR 通過(guò)抑制協(xié)同自噬起始的ULK1負(fù)調(diào)控自噬［26］。本研究發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤湯可降低A549細(xì)胞中P13K、Akt以及mTOR磷酸化水平，提示扶正抑瘤湯可能通過(guò)抑制P13K/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)自噬，從而抑制A549細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)扶正抑瘤湯是治療NSCLC的潛在有效藥物，可以抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與扶正抑瘤湯阻斷P13K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。