王小鵬，黃敏興*，許卓妍，楊李勝，劉志鵬，余構(gòu)彬

(1廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東廣州510316；2中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316)

0 前言

植物類多酚是多羥基酚類化合物的總稱，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)具有獨(dú)特生物活性的次生代謝物。作為植物天然產(chǎn)物，植物多酚因其結(jié)構(gòu)的多樣性而具有多種生物活性[1]。近年來，植物多酚的生物活性及功能性作用不斷被挖掘。相關(guān)研究表明，植物多酚具有清除自由基、抗氧化、食品保鮮、抑菌抗菌、抗病毒、抑制癌癥、治療心腦血管疾病等多種功能性作用[2-4]。隨著植物多酚研究領(lǐng)域往縱深方向發(fā)展，進(jìn)一步細(xì)化多酚物質(zhì)的分類以及功能性作用具有深遠(yuǎn)意義。而高效高靈敏度的定性定量檢測方法能夠明確多酚的組分組成及各組分的含量，是多酚功能性作用走向精細(xì)化研究的重要技術(shù)支撐手段。因此針對不同植物基質(zhì)特性，開發(fā)專屬性較強(qiáng)的高效高靈敏度檢測方法具有重要意義。

甘蔗是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是食糖生產(chǎn)的重要來源，年產(chǎn)量居世界第 3，但與外國制糖產(chǎn)業(yè)相比，我國甘蔗制糖產(chǎn)業(yè)整體經(jīng)濟(jì)效益存在一定差距，主要體現(xiàn)在綜合利用率不高，甘蔗及其副產(chǎn)物資源高值化利用率相對較低，因此提高甘蔗及其副產(chǎn)物的高值化利用將成為提升甘蔗制糖行業(yè)整體經(jīng)濟(jì)效益的必經(jīng)之路。甘蔗組織中含有豐富的多酚物質(zhì)，提取甘蔗多酚并進(jìn)行功能性應(yīng)用研究將是甘蔗高值化利用的重要途徑[5-7]。

甘蔗中多酚定性定量檢測方法是功能性應(yīng)用研究的重要技術(shù)支撐手段，但當(dāng)前甘蔗多酚檢測方面的研究主要集中在提取階段，高效高靈敏度的多組分多酚檢測方法研究相對較少。目前多酚物質(zhì)的檢測方法主要有高效液相色譜法[8-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13-15]等。高效液相色譜法易受復(fù)雜基質(zhì)的干擾，對分析多種多酚具有一定的局限性。而液相色譜-質(zhì)譜法具有強(qiáng)大的抗干擾能力，靈敏度高，可以準(zhǔn)確定性定量。本文擬以甘蔗為研究對象，建立甘蔗中11種多酚的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，以期為甘蔗多酚的功能性應(yīng)用研究提供技術(shù)支撐手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Altus A-30超高效液相色譜儀(美國鉑金埃爾默公司)，5500 Qtrap質(zhì)譜儀(美國Sciex公司)，色譜柱Atlantis T3 (3 μm，150 mm×3.0 mm)(美國沃特世公司)；WIGGENS Vortex 3000渦旋振蕩器(北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；H1850R臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。

11種多酚標(biāo)準(zhǔn)品(≥99.5%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；甲醇(色譜純，默克股份兩合公司)；甲酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；0.22 μm有機(jī)相濾膜(廣州彼西絡(luò)科技有限公司)。

1.2 樣品前處理

將廣州市面上采購的新鮮甘蔗洗凈，放入攪拌機(jī)攪碎，稱取2.00 g(精確到0.01 g)樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL甲醇，渦旋10 min，40℃超聲60 min，以5000 r/min速度離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待上機(jī)。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min，90% A；1.0～5.0 min，90%～10% A；5.0～8.5 min，10% A；8.5～8.6 min，10%～90% A；8.6～10.0 min，90% A；流速：0.5 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧負(fù)離子電離(ESI-)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；噴霧電壓：-4500 V；離子源溫度：550℃；霧化氣壓力：55 psi；氣簾氣壓力：44 psi；輔助加熱氣壓力：40 psi；碰撞氣壓力：中檔。定量和定性離子、去簇電壓等參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

表1 11種多酚物質(zhì)的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，50 mm ×2.1 mm)、Ultra AQ C18(3 μm，100 mm×2.1 mm)、Atlantis T3 (3 μm，150 mm×3.0 mm)3 種不同色譜柱對 11種多酚物質(zhì)的分離效果。結(jié)果表明，Atlantis T3色譜柱對11種多酚物質(zhì)較另外2種色譜柱具有更好的保留和分離效果，目標(biāo)化合物峰形不會出現(xiàn)分叉，拖尾現(xiàn)象不明顯，響應(yīng)值高，3種色譜柱的分離效果見圖1～3，因此，本實(shí)驗(yàn)選用Atlantis T3色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

圖1 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱對11種多酚物質(zhì)分離效果

圖2 Ultra AQ C18色譜柱對11種多酚物質(zhì)分離效果

圖3 Atlantis T3色譜柱對11種多酚物質(zhì)分離效果

采用針對極性物質(zhì)分析效果較好的Atlantis T3(3 μm，150 mm×3.0 mm)色譜柱，分別比較了超純水-乙腈、0.01%氨水-乙腈、0.01%氨水-甲醇、超純水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇 5種不同流動(dòng)相組合的分離效果。結(jié)果表明，采用0.1%甲酸水-甲醇流動(dòng)相組合能最大程度上調(diào)節(jié)酸度，抑制解離，提高靈敏度，且峰形尖銳對稱，分離度好，故選擇 0.1%甲酸水-甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑萃取法結(jié)合超聲萃取法。多數(shù)文獻(xiàn)[16-17]采用丙酮、乙酸乙酯、甲醇分步提取多酚物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)比較后精化了提取步驟，只用甲醇作為提取溶劑。為了進(jìn)一步探究提取溶劑濃度(60%甲醇水、80%甲醇水、100%甲醇)、超聲時(shí)間(30、60、120 min)、超聲溫度(40、60、80℃) 3個(gè)因素3個(gè)水平對最終實(shí)驗(yàn)的影響，利用正交設(shè)計(jì)助手軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對設(shè)計(jì)出來的 9個(gè)具有代表性的組合進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)探究，具體正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。當(dāng)選擇純甲醇(100%甲醇)作為提取溶劑，溫度40℃超聲60 min時(shí)可以達(dá)到最佳提取效果，平均加標(biāo)回收率為93.2%。

2.3 回收率和精密度

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

采用逐級稀釋法結(jié)合3倍濃度除以信噪比計(jì)算得到 11種多酚物質(zhì)的檢出限。在空白樣品中加入100 μg/kg的11種多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測定6次，結(jié)果見表3。當(dāng)線性范圍為5～200 μg/L時(shí)，其相關(guān)系數(shù)在0.9990～1.0000之間，檢出限在0.5～17.0 μg/kg之間，回收率在89.4%～102.4%之間，精密度在0.9%～4.3%之間。

2.4 樣品分析

對來自廣東不同種植區(qū)域采集的6份甘蔗樣品進(jìn)行不同部位的試驗(yàn)分析，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，6份甘蔗樣品均檢出香草酸、綠原酸、對香豆酸、兒茶素、阿魏酸、沒食子酸、咖啡酸、槲皮素、原花青素B2，未檢出表兒茶素、反鄰香豆酸。

3 結(jié)論

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和精密度(n=6)

表4 11種多酚類物質(zhì)在甘蔗中的檢測結(jié)果 單位：mg/kg

本研究通過對前處理、色譜、質(zhì)譜等條件的優(yōu)化，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定甘蔗中11種多酚類物質(zhì)的方法，該方法簡便、快速、高效，且回收率及精密度均滿足實(shí)驗(yàn)要求，選擇性強(qiáng)，適應(yīng)性良好，可用于甘蔗中多酚類物質(zhì)含量的批量測定。同時(shí)也為甘蔗各部位的充分利用、有益物質(zhì)開發(fā)、組織培養(yǎng)降低酚害提供了技術(shù)參考。