李依琳，李勇，楊燁，尚海瓊，林小燕，高馨怡，劉湘

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是特應(yīng)性個(gè)體在接觸過(guò)敏原后鼻黏膜產(chǎn)生由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的非感染性炎癥反應(yīng)性疾病[1]。大量研究表明，AR的發(fā)生發(fā)展由多個(gè)遺傳基因調(diào)控[2-3]，但具體的基因調(diào)控機(jī)制尚不明確。AR患者血液IL-4 高水平表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)特異性IgE的合成和分泌，加快炎癥細(xì)胞的成熟、聚集，從而誘導(dǎo)過(guò)敏性疾病的發(fā)生[2,4-5]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt，但缺乏翻譯能力的RNA。有研究發(fā)現(xiàn)，在變態(tài)反應(yīng)過(guò)程中，多種lncRNA通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和激活發(fā)揮免疫調(diào)控的作用[6-8]。在lncRNA中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA-RTL1(long non-coding RNA-RTL1， lnc-RTL1)位于人體14號(hào)染色體的DLK1-DIO3印記域，屬于父本表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因[9],筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1存在差異性表達(dá)，但其和AR臨床指標(biāo)之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平，分析lnc-RTL1表達(dá)與AR相關(guān)臨床指標(biāo)(癥狀及生活質(zhì)量評(píng)分、血清IL-4)的關(guān)系，從轉(zhuǎn)錄后水平研究AR的潛在病理生理機(jī)制，為AR的預(yù)防和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象的選擇

選取2019年7月至2020年1月在杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院的48例患者，其中實(shí)驗(yàn)組25例，為伴鼻中隔偏曲的AR患者，男17例，女8例；對(duì)照組23例，為單純鼻中隔偏曲患者，男19例，女4例。

AR納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡在18至60歲之間，性別不限；(2)全部患者均根據(jù)變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015年,天津)[10]診斷為AR，同時(shí)患有鼻中隔偏曲且下鼻甲明顯肥大，要求手術(shù)治療；(3)表現(xiàn)出的AR癥狀典型；(4)有明確的過(guò)敏原陽(yáng)性指標(biāo)，如皮膚點(diǎn)刺結(jié)果顯示塵螨陽(yáng)性或血清過(guò)敏原特異性IgE抗體顯著升高；同時(shí)滿(mǎn)足所有條件者可納入實(shí)驗(yàn)組。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，如凝血功能障礙、良惡性腫瘤及免疫缺陷性疾病；(2)患有鼻息肉、真菌性鼻竇炎等鼻炎相關(guān)性疾??；(3)2周內(nèi)有全身或鼻腔抗組胺藥物或類(lèi)固醇激素使用史；(4)正在或既往有過(guò)特異性免疫治療史；(5)AR相關(guān)癥狀視覺(jué)量表評(píng)分≤3分，滿(mǎn)足于以上任一選項(xiàng)者不納入研究對(duì)象。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)渭兓加斜侵懈羝也话橛蠥R，并要求手術(shù)的患者。本研究經(jīng)過(guò)杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署患者知情同意書(shū)。

試劑Human Interleukin 4(IL4) ELISA試劑盒(48T*1)，上海藍(lán)基生物科技有限公司生產(chǎn)；RNA loading buffer，Solarbio公司生產(chǎn)；TRIZOL試劑及組織RNA提取試劑盒，Thermofisher公司生產(chǎn)；Sybgreen實(shí)時(shí)熒光定量試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集及癥狀評(píng)分

收集48例研究對(duì)象的一般臨床資料，按照納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)分為AR組及對(duì)照組，AR組研究對(duì)象在研究人員的指導(dǎo)下完成RQLQ和VAS問(wèn)卷。RQLQ量表采用問(wèn)卷調(diào)查的方式對(duì)AR患者的日?；顒?dòng)、社交活動(dòng)、睡眠質(zhì)量、鼻部癥狀、眼部癥狀、情緒等方面做出評(píng)分，以數(shù)字0～6表示，0-沒(méi)有困擾, 6-極度困擾,數(shù)字越大困擾程度越深[11]。VAS量表為10 cm長(zhǎng)的橫向刻度卡尺，對(duì)患者的鼻癢、鼻塞、流涕及打噴嚏癥狀做出評(píng)價(jià)，一端標(biāo)0表示無(wú)癥狀；另一端為10表示癥狀難以忍受；中間數(shù)字依次表示程度遞增，受試者根據(jù)主觀感受在直線上作記號(hào)以表示強(qiáng)度，測(cè)量起點(diǎn)至記號(hào)處的距離為測(cè)量值[12]。所有表單的填寫(xiě)由同一位研究人員負(fù)責(zé)，以確保表單的真實(shí)性及完整性。

1.2.2 樣本收集

在無(wú)菌操作下采集48例研究對(duì)象1～2 mL外周血，所取血液樣本室溫靜置2 h，再于3 500 r/min離心15 min取其上清液，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。48例患者均需行鼻中隔矯正術(shù)和下鼻甲減容術(shù)，術(shù)前需提前兩周停用激素類(lèi)藥物，并每日沖洗清理鼻腔，術(shù)中取部分下鼻甲后端黏膜組織，快速放入生理鹽水中清洗干凈后，取部分標(biāo)本放入含有RNA-Later固定液的試管中，充分搖勻后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

通過(guò)酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測(cè)AR患者外周血IL-4的濃度，檢測(cè)方法嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。操作步驟如下：取出Human IL-4 ELISA試劑盒，于室溫(20～25 ℃)下放置30 min；取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中；然后向空白微孔中加入100 μL的樣品，空白對(duì)照管則加入100 μL的蒸餾水；接著在各孔中加入50 μL的酶標(biāo)記溶液(不含空白對(duì)照孔)；用封口膠將酶標(biāo)板密封后，置于37 ℃恒溫恒濕環(huán)境下孵育反應(yīng)1 h；孵育完成后取出，充分清洗酶標(biāo)板3～5次，保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)，洗滌后用吸水紙徹底拍干。接著于各孔依次加入顯色劑A 50 μL及顯色劑B 50 μL。放置于20～25 ℃下避光反應(yīng)10 min。最后各孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。

1.2.4 RNA的提取和qRT-PCR

取部分鼻黏膜組織經(jīng)液氮研磨后，重復(fù)PBS洗滌組織標(biāo)本兩次，加入1 mL Trizol裂解液，經(jīng)過(guò)充分混勻后于室溫環(huán)境靜置10 min；然后混合200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，重復(fù)室溫靜置10 min；經(jīng)過(guò)12 000 r/min、4 ℃離心15 min后，取上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管中；加入等體積異丙醇，輕輕混勻，放置于室溫靜置10 min；再次12 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，取沉淀，用75%乙醇洗滌2次；風(fēng)干后用15～ 30 μL DEPC水溶解得到 RNA 原液。電腦運(yùn)行NanoDrop 2000軟件，并選定測(cè)RNA，然后使用RNA free的水洗測(cè)試頭3次，并使用無(wú)塵紙擦干，接著使用0.1% DEPC水作為空白對(duì)照調(diào)零，最后吸取1 μL的待測(cè)樣品加到測(cè)試頭上，選擇測(cè)定RNA濃度，將測(cè)定好的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)兩組患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平，PCR引物序列如下：GAPDH-F:5′-T-GTTGCCATCAAT-GACCCCT-3′,GAPDH-R:5′-CTC-CACGACGTACTCAGCG-3′;lnc-RTL1-8:1-F:5′-AC-CTTGGAGCCTGCTTACG-3′,lnc-RTL1-8:1-R: 5′-GG-TTCTTCCATGTCC-AGCAT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism7.0和SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異性分析，采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平與血清特異性IL-4、AR癥狀評(píng)分的相關(guān)性。P<0.05認(rèn)為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

25例AR患者，男女比例為17∶8，發(fā)病年齡13～64歲，平均年齡38.2歲。對(duì)照組23例，男女比例為19∶4，年齡24～58歲，平均年齡41.6歲。收集兩組患者臨床特征資料，兩組男女性別、年齡以及相關(guān)疾病比例均通過(guò)卡方檢驗(yàn)(P>0.05)(表1)。VAS評(píng)分AR組平均98.92分，對(duì)照組平均69.43分；RQLQ評(píng)分AR組平均84.28分，對(duì)照組平均63.09分。

2.2 樣本數(shù)據(jù)

ELISA檢測(cè)研究對(duì)象外周血血清IL-4的濃度，AR組高于對(duì)照組(圖1)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)兩組患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AR組患者鼻黏黏膜中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。對(duì)鼻黏膜中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平與血清IL-4水平進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)(圖3)；鼻黏膜中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平與AR患者RQLQ和VAS問(wèn)卷評(píng)分進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.001)(圖4～5)。

圖 2 變應(yīng)性鼻炎組及對(duì)照組鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1的表達(dá)

圖 3 AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平與血清IL-4的相關(guān)性

圖 4 AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平與VAS癥狀評(píng)分的相關(guān)性

圖 5 AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平與RQLQ生活質(zhì)量評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

AR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前多數(shù)學(xué)者的研究主要集中在“Th1/Th2細(xì)胞平衡學(xué)說(shuō)”、“Treg/Th17平衡學(xué)說(shuō)”、IL-5、IL-6、IL-17等多種細(xì)胞因子水平[13-17]，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)Th9、中性粒細(xì)胞及新發(fā)現(xiàn)的 2 型固有淋巴樣細(xì)胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2)也參與了AR的發(fā)病并影響治療反應(yīng)[18-19]。AR的發(fā)病過(guò)程中有眾多炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子等共同參與，其中IL-4、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫并作用于B細(xì)胞，主要功能為刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生免疫球蛋白G1和IgE抗體[14]。IL-4能夠加強(qiáng)B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的抗原遞呈作用，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，臨床上表現(xiàn)出AR的癥狀[20-21]，研究表明AR患者血清中IL-4常較正常人偏高[22]。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)AR患者和健康人血清IL-4水平，結(jié)果顯示AR患者血清中IL-4表達(dá)水平明顯高于健康人，與上述研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，血清IL-4參與了AR的病理發(fā)生過(guò)程，與AR的關(guān)系十分密切。

隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在部分疾病的發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用[23],曾一度被認(rèn)為是無(wú)功能“轉(zhuǎn)錄垃圾”的非編碼RNA，近年來(lái)被證實(shí)在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程以及細(xì)胞分化、生物發(fā)育中發(fā)揮巨大作用[24]。其中長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼RNA,被認(rèn)為參與了表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控，并積極參與包括癌癥在內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程和病理狀態(tài)[25]。有研究在14q32號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)印記簇，包括DIO3基因區(qū)域的父系表達(dá)印跡基因之一lnc-RTL1[26]，筆者前期研究應(yīng)用基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)lnc-RTL1在AR患者鼻黏膜組織中存在顯著差異性表達(dá)，可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)下游信號(hào)分子表達(dá)參與AR發(fā)病機(jī)制中某些特定的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路[27]。在前期研究的基礎(chǔ)上本研究進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)lnc-RTL1在AR患者和健康人群中均有表達(dá)，發(fā)現(xiàn)前者lnc-RTL1表達(dá)水平高于后者且具有顯著差異，提示lnc-RTL1在AR的發(fā)生發(fā)展中可能起正向基因調(diào)控作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)作為參與非特異性免疫的一類(lèi)重要蛋白質(zhì)分子，調(diào)控Thl/Th2應(yīng)答[28-29]。TLR能夠激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)介質(zhì)——促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)等，從而誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)。有研究通過(guò)建立變應(yīng)性鼻炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)，在Toll樣受體核因子通路(TLR-NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)中，NF-κB高表達(dá)可抑制IL-4的生成并促進(jìn)干擾素-γ的生成，導(dǎo)致免疫偏移[30]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cεRI信號(hào)通路中的MAPK13基因?yàn)閘nc-RTL1的潛在調(diào)控靶點(diǎn)[31]，提示lnc-RTL1可能在基因?qū)用嫔蠈?duì)Toll樣受體表達(dá)有調(diào)控作用。

Qian等[8]進(jìn)行相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL與IL-4、IL-6、IL-13均呈正相關(guān)，與IL-10和IFN-α呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明lncRNA在基因?qū)用嫔蠈?duì)AR的發(fā)病機(jī)制和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生具有一定程度的調(diào)控作用。本研究對(duì)AR鼻黏膜上皮細(xì)胞lncRNA lnc-RTL1與血清IL-4水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AR患者鼻黏膜lnc-RTL1表達(dá)水平與血清IL-4水平無(wú)明顯相關(guān)性，提示lnc-RTL1可能不參與IL-4的蛋白表達(dá)調(diào)控，而是通過(guò)調(diào)控其他AR相關(guān)細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)，從而對(duì)AR的發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生一定作用。

AR癥狀反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至生長(zhǎng)發(fā)育。目前評(píng)價(jià)AR癥狀嚴(yán)重程度最常用的疾病專(zhuān)用量表是RQLQ以及VAS量表。通過(guò)Spearman相關(guān)分析，本研究進(jìn)一步對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞中l(wèi)nc-RTL1表達(dá)水平與AR患者炎癥癥狀的相關(guān)性進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)lnc-RTL1表達(dá)水平與AR患者主觀癥狀評(píng)分和生活質(zhì)量評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，即AR病情越嚴(yán)重，鼻黏膜lnc-RTL1表達(dá)水平越低。由于lnc-RTL1在AR患者鼻黏膜中表達(dá)水平較正常人高，提示lnc-RTL1可能是一項(xiàng)AR保護(hù)性指標(biāo)。

本研究從鼻黏膜lnc-RTL1表達(dá)與血清IL-4以及AR患者癥狀的關(guān)系角度著手研究，探討lnc-RTL1表達(dá)水平與AR嚴(yán)重程度的相關(guān)性，從基因?qū)用嫔蠟锳R的預(yù)防和治療提供研究新思路。由于樣本量及研究條件限制，且本研究只從lnc-RTL1入手研究，還存在一定的不足，目前l(fā)nc-RTL1在AR發(fā)病機(jī)制中的研究尚未成熟，有待于在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行更加深入的探索。