凌曉靜，許志強(qiáng)，胡巧麗，潘晨，朱理想，魏繼福

過敏性疾病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐步升高，其中花粉誘導(dǎo)的過敏性疾病也呈逐步上升趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國蒿屬植物有187種，主要分布于我國北方和西南地區(qū)，是引起過敏性鼻炎和氣道高反應(yīng)性疾病的主要室外過敏原[2-4]。蒿屬植物花粉顆粒較小，直徑為19～25 μm易隨風(fēng)飄散，產(chǎn)粉量大，且患者過敏癥狀的嚴(yán)重程度與空氣中花粉含量呈相關(guān)性，蒿屬花粉是我國北方夏秋季主要?dú)鈧餍曰ǚ圻^敏原[1,5-6]。其中，大籽蒿(ArtemisiasieversianaWilld)、黃花蒿(A.annuaL.)和艾蒿(A.vulgaris)是我國蒿屬致敏花粉的三大主要來源，不同于歐洲以艾蒿花粉為主[4]。然而，目前用于過敏原特異性IgE檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”ImmunoCAP，其檢測對象還是主要針對艾蒿(商品編碼：w6)、苦艾蒿(商品編碼：w5)以及部分已鑒定的艾蒿過敏原分子Art v 1(商品編碼：w231)和Art v 3(商品編碼：w233)。雖然國內(nèi)已有黃花蒿花粉變應(yīng)原點(diǎn)刺液和注射液產(chǎn)品，但其中未明確具體過敏原分子信息,極大地限制了產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的制定、患者致敏特征和治療效果在分子水平上的評估以及診斷產(chǎn)品和疫苗的進(jìn)一步研究發(fā)展。迄今為止，已被國際免疫學(xué)聯(lián)合會(International Union of Immunological Societies, WHO/IUIS)命名的黃花蒿花粉過敏原分子共有4種，分別為A.annua1[7]、A.annua2[7]、A.annua3[7]和A.annua7[7-8](http://www. allergen.org)，相比于其同屬物種艾蒿已鑒定的6種過敏原分子(Art v 1-6)[9-14]， 對黃花蒿花粉過敏原分子的研究較少，仍可能存在未明確過敏原。本研究結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)對黃花蒿花粉進(jìn)行分析并尋找其中潛在新過敏原，進(jìn)一步完善黃花蒿花粉中致敏組分信息及其在中國人群中的致敏特征，以促進(jìn)精準(zhǔn)的分子診斷和治療發(fā)展。

1 方法與材料

1.1 材料

黃花蒿花粉轉(zhuǎn)錄組測序由北京奧維森基因科技有限公司負(fù)責(zé)，南京金斯瑞生物科技有限公司主要負(fù)責(zé)DNA引物合成以及克隆菌基因測序。PCR試劑盒(TaKaRa Ex Taq, 10×Ex Taq Buffer, dNTP Mixture)，TA克隆試劑盒(pMDTM19-T Vector Cloning Kit)，DNA凝膠純化試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)，pET-28a質(zhì)粒載體限制性雙切酶(QuickCutTMXho Ⅰ和QuickCutTMNco Ⅰ)，異丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl thiogalactoside, IPTG)等都購于寶生物工程(大連)有限公司。重組克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ one step Cloning Kit)購于諾維贊公司。純化重組蛋白的high affinity Ni-NTA resin購于金斯瑞生物科技有限公司。用于ELISA實(shí)驗(yàn)的四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)顯色液、終止液購于碧云天生物技術(shù)公司，Anti-IgE(辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗人的IgE)購于美國KPL公司。 Western blot實(shí)驗(yàn)中的ECL顯影液和PVDF膜均購于Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 黃花蒿花粉烯醇化酶基因克隆和擴(kuò)增

將轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與WHO/IUIS過敏原數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST(basic local alignment search tool, BLAST)同源序列比對分析，得到一個(gè)與其他物種過敏原同源的黃花蒿花粉烯醇化酶(enolase)潛在過敏原序列。根據(jù)所得烯醇化酶cDNA序列設(shè)計(jì)引物5′-CGGGGGATTCCAGTTTC-3′，5′-GATTGCATGGACACTCAAC-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對產(chǎn)物TA克隆并測序進(jìn)一步驗(yàn)證。根據(jù)序列編碼區(qū)設(shè)計(jì)重組引物并克隆至pET-28a的NcoⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒。

1.2.2 黃花蒿花粉烯醇化酶序列比對

根據(jù)allergome數(shù)據(jù)庫(http://www.allergen. org)中收錄的已報(bào)道蛋白類型屬于烯醇化酶的過敏原序列，利用clustalX2與黃花蒿花粉烯醇化酶進(jìn)行多重序列比對，分析與其他物種烯醇化酶氨基酸序列之間的保守性。運(yùn)用MEGA7采用鄰近法(N-J法)構(gòu)建進(jìn)化樹分析其進(jìn)化關(guān)系。

1.2.3 黃花蒿花粉烯醇化酶的表達(dá)和純化

將已經(jīng)構(gòu)建好的含有編碼黃花蒿花粉烯醇化酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入終濃度1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳驗(yàn)證并挑選能夠表達(dá)目的蛋白的菌落并進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式后，變性條件下(100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)通過Ni2+親和層析純化目的蛋白并使用梯度透析法(8→6→4→2→0 mol/L)除去蛋白中的尿素進(jìn)行蛋白復(fù)性。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent reaction, ELISA)

將1μg的重組黃花蒿花粉烯醇化酶于4 ℃過夜包被至ELISA板孔中，并用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。后加入1∶10稀釋于PBS-0.1% Tween 20的蒿屬過敏患者血清100μL/孔，37 ℃孵育2 h后使用PBS-0.1% Tween 20進(jìn)行洗滌，使用HRP標(biāo)記的羊抗人IgE作為二抗和TMB顯色液對結(jié)合在黃花蒿花粉烯醇化酶上的IgE進(jìn)行檢測。

1.2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

10 μg的黃花蒿烯醇化酶經(jīng)過SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)過5%脫脂牛奶封閉后，與ELISA中陽性的血清(1∶10稀釋于PBS-0.1% Tween 20)在4 ℃孵育過夜，洗滌后使用HRP標(biāo)記的羊抗人IgE和化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)合在PVDF膜上黃花蒿花粉烯醇化酶的IgE。

1.2.6 競爭抑制實(shí)驗(yàn)(inhibition enzyme-linked immunosorbent reaction, iELISA)

2 結(jié)果

2.1 黃花蒿花粉烯醇化酶基因的克隆和擴(kuò)增

轉(zhuǎn)錄組測序所得黃花蒿烯醇化酶基因序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小在1 000～2 000 bp之間(圖1A)。隨后對產(chǎn)物克隆和測序得到一個(gè)長度為1 433 bp的基因片段，開放閱讀框?yàn)? 335 bp，編碼444個(gè)氨基酸(圖1B)。根據(jù)clustalX2的多重序列比對，黃花蒿花粉烯醇化酶與矮豚草Amb a 12的相似性最高(91%)，其次為橡膠樹Hev b 9(89%)，與玉米Zea m 22和百慕大草Cyn d 22相似性均為88%，與其他14個(gè)烯醇化酶過敏原的氨基酸序列的相似性在56%～68%之間(圖2)。對黃花蒿花粉烯醇化酶與18個(gè)其他來源的烯醇化酶過敏原進(jìn)行進(jìn)化樹分析，黃花蒿花粉烯醇化酶與矮豚草Amb a 12聚為一簇，同屬于菊科植物，自展值為72。黃花蒿花粉烯醇化酶連同Amb a 12又與大戟科橡膠樹乳膠Hev b 9聚成一簇，自展值為63(圖1C)。

2.2 黃花蒿花粉烯醇化酶的表達(dá)、純化

根據(jù)誘導(dǎo)超聲后SDS-PAGE電泳圖驗(yàn)證蛋白主要以包涵體表達(dá)(箭頭處所示)，重組蛋白C末端含有加入的六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，在變性條件下經(jīng)鎳離子Ni2+親和凝膠層析純化后經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，在相對分子質(zhì)量55 000附近顯示出一條單一的蛋白條帶(圖3A)。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)以及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

ELISA驗(yàn)證黃花蒿花粉烯醇化酶與過敏患者血清中IgE結(jié)合活性，在38份蒿屬過敏患者血清中有9份OD值大于cut off值(cut off值=陰性血清反應(yīng)吸光度的平均值+3×陰性血清吸光度標(biāo)準(zhǔn)偏差)，其IgE結(jié)合率為24%(9/38)(圖3B)。利用免疫印跡對黃花蒿花粉烯醇化酶的IgE結(jié)合活性進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)9份ELISA陽性結(jié)合血清中，5份可以在免疫印跡中顯示出陽性結(jié)合條帶(圖3C)。

2.4 抑制性酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)

在黃花蒿花粉粗提物和重組蛋白濃度為1 μg/mL時(shí)，花粉提取物與重組烯醇化酶可分別抑制96.00%和11.83%血清IgE與花粉提取物的結(jié)合(圖3D)。

3 討論

蒿屬花粉被認(rèn)為是我國最重要的室外過敏原之一[3]。黃花蒿花粉作為三大蒿屬致敏花粉中的一員[4]，根據(jù)WHO/IUIS數(shù)據(jù)庫僅有4種過敏原分子已被鑒定，分別是A.annua1(防御素樣蛋白)[7]、A.annua2(病程相關(guān)蛋白)[7]、A.annua3(脂質(zhì)運(yùn)載蛋白)[7]和A.annua7(半乳糖氧化酶)[7-8]。本研究通過對黃花蒿花粉轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和蛋白組學(xué)

圖 1 黃花蒿花粉烯醇化酶序列信息和進(jìn)化樹

圖 2 黃花蒿花粉烯醇化酶與其他物種中同源過敏原多重序列比對

圖 3 黃花蒿花粉烯醇化酶表達(dá)、純化和活性(SDS-PAGE電泳及Western blot圖中箭頭所指為目的蛋白條帶)

綜上，從黃花蒿花粉中鑒定到一個(gè)新過敏原烯醇化酶，并首次在蒿屬花粉中證明烯醇化酶的IgE結(jié)合活性，進(jìn)一步完善了蒿屬花粉中的具體過敏原組分信息，為組分診斷和治療提供基礎(chǔ)。