王遠明 李楚凌 羅香林 許德瑜 徐亞雄

【摘要】 目的：探討白介素-33（IL-33）在變應性鼻炎患兒中的表達和對Th2和Th17炎癥反應的調(diào)控作用。方法：選取2017年1-6月就診于本院的50例變應性鼻炎患兒，根據(jù)是否合并哮喘分為變應性鼻炎組（n=40）與變應性鼻炎伴哮喘組（n=10），另選取同期于本院體檢的20例正常兒童作為對照組。比較三組血清和鼻腔灌洗液中IL-33和Th2、Th17細胞因子的表達情況，分析變應性鼻炎患兒IL-33和Th相關細胞因子的相關性。純化外周血單個核細胞進行IL-33的體外調(diào)節(jié)實驗，分析重組IL-33和相關細胞因子對外周血單個核細胞Th2和Th17炎癥反應的調(diào)控作用。結果：變應性鼻炎組與變應性鼻炎伴哮喘組中血清和鼻腔灌洗液IL-33、IL-4、IL-5、IL-17均高于對照組，且變應性鼻炎伴哮喘組均高于變應性鼻炎組（P<0.05）。變應性鼻炎患兒血清和鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5、IL-17均與IL-33表達呈正相關（P<0.05）。血清ECP、粉塵螨特異性IgE水平及嗜酸性粒細胞計數(shù)均與血清IL-33表達呈正相關（P<0.05）。HDM和1、10、100 ng/mL rhIL-33的IL-4、IL-5、IL-17水平均高于PBS，且10、100 ng/mL rhIL-33均高于1 ng/mL rhIL-33（P<0.05）。100 ng/mL rhIL-33的IL-4、IL-5及IL-17水平均高于HDM（P<0.05）。HDM+anti-IL-33的IL-4、IL-5及IL-17水平均高于PBS，而低于HDM（P<0.05）。結論：變應性鼻炎中IL-33的表達上調(diào)促進了Th2和Th17炎癥反應，并為IL-33在變應性鼻炎發(fā)病機制中的調(diào)節(jié)作用提供了可能的解釋。

【關鍵詞】 白介素-33 變應性鼻炎 兒童

[Abstract] Objective： To investigate the expression of interleukin-33 （IL-33） in children with allergic rhinitis and its regulation of Th2 and Th17 inflammatory responses. Method： A total of 50 children with allergic rhinitis admitted to our hospital from January to June 2017 were selected， they were divided into allergic rhinitis group （n=40） and allergic rhinitis with asthma （n=10） according to whether they had asthma or not. Another 20 normal children underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. The expression of IL-33 and Th2 and Th17 cytokines in serum and nasal lavage fluid of three groups were compared. The correlation between IL-33 and Th related cytokines in children with allergic rhinitis were analyzed. Purified peripheral blood mononuclear cells were used to conduct in vitro IL-33 regulation experiments， and the regulatory effects of recombinant IL-33 and related cytokines on Th2 and Th17 inflammatory response of peripheral blood mononuclear cells were analyzed. Result： The serum and nasal lavage fluid IL-33， IL-4， IL-5 and IL-17 in allergic rhinitis group and allergic rhinitis with asthma group were higher than those in the control group， and those in allergic rhinitis with asthma group were higher than those in allergic rhinitis group （P<0.05）. The expression of IL-4， IL-5 and IL-17 in serum and nasal lavage fluid of children with allergic rhinitis were positively correlated with IL-33 （P<0.05）. Serum ECP， dust mite specific IgE levels and eosinophil count were positively correlated with serum IL-33 expression （P<0.05）. The levels of IL-4， IL-5 and IL-17 in HDM and 1， 10， 100 ng/mL rhIL-33 were higher than those in PBS， and those in 10 and 100 ng/mL rhIL-33 were higher than those in 1 ng/mL rhIL-33 （P<0.05）. IL-4， IL-5 and IL-17 levels in 100 ng/mL rhIL-33 were higher than those in HDM （P<0.05）. The levels of IL-4， IL-5 and IL-17 in HDM+anti-IL-33 were higher than those in PBS， but were lower than those in HDM （P<0.05）. Conclusion： Up-regulated IL-33 protein in allergic rhinitis promote Th2 and Th17 inflammation， and provide a possible explanation for IL-33s regulatory role in the pathogenesis of allergic rhinitis.

[Key words] IL-33 Allergic rhinitis Children

First-authors address： Dongguan Women and Childrens Hospital， Dongguan 523000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.06.003

變應性鼻炎是耳鼻喉科常見的過敏性疾病，兒童患病率達10%～40%，且在國內(nèi)患病率有日益增加的趨勢[1-2]。變應性鼻炎的組織學特征包括Th2炎癥反應的增強，嗜酸性粒細胞浸潤，變應原特異性IgE的產(chǎn)生和基底膜增厚[3-4]。Th2細胞的激活和進一步釋放的細胞因子誘導各種免疫細胞的聚集，導致了變應性鼻炎的發(fā)生[5]。最近研究表明，Th17細胞可以增強哮喘小鼠模型中Th2細胞介導的嗜酸性粒細胞氣道炎癥[6-7]。此外，變應性鼻炎患者血清白介素-17（IL-17）水平的有所增加，且其與臨床癥狀、外周嗜酸性粒細胞計數(shù)和藥物相關[8-9]。白介素-33（IL-33）是IL-1超家族成員，其受體為ST2[10]。IL-33與其在不同細胞表面的ST2受體之間的相互作用進而促進Th2反應[11]。在變應性鼻炎中，IL-33與疾病嚴重程度相關[12-13]。在變應性鼻炎的實驗性小鼠模型中，過敏原暴露誘導鼻上皮細胞產(chǎn)生IL-33，并且通過增加肥大細胞釋放組胺和誘導嗜堿性粒細胞產(chǎn)生趨化因子，這對于鼻黏膜中嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的積累起關鍵作用[14]。越來越多的證據(jù)表明，IL-33可能在Th2和Th17相關的變應性鼻炎中發(fā)揮積極作用。本研究旨在探討IL-33在變應性鼻炎中的表達和對Th2和Th17炎癥反應的調(diào)控作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1-6月就診于本院的50例變應性鼻炎患兒。納入標準：5～12歲;根據(jù)疾病史（臨床癥狀噴嚏、清水樣涕、鼻塞、鼻癢等癥狀出現(xiàn)2項以上，每天癥狀持續(xù)或累計在1 h以上），體格檢查（鼻黏膜蒼白、雙下甲水腫，總鼻道及鼻底可見清涕或粘涕），皮膚點刺試驗和特異性IgE的檢測（主要包括常見過敏原，如塵螨、貓毛、狗毛等）符合變應性鼻炎2010年版指南和全球哮喘倡議（GINA）的診斷標準[15-16]。排除標準：慢性疾?。ㄈ鐮I養(yǎng)不良，呼吸系統(tǒng)解剖畸形，慢性肺病，心臟病，胃食管反流病，囊性纖維化）;一個月內(nèi)有藥物使用史（如口服或鼻用皮質(zhì)類固醇，抗癲癇藥，免疫抑制劑）。50例變應性鼻炎患兒根據(jù)是否合并哮喘分為變應性鼻炎組（n=40）與變應性鼻炎伴哮喘組（n=10）。另選取同期于本院體檢的20例正常兒童作為對照組。本研究經(jīng)東莞市婦女兒童醫(yī)院倫理委員會批準，并由兒童父母簽署知情同意書。

1.2 方法 每組抽血時間為晨起空腹8～9點。靜脈血樣品收集到真空管中并在3 000 g 4 ℃離心15 min。使用LH-785系統(tǒng)（愛爾蘭Beckman Coulter公司）進行全血細胞計數(shù)。使用Unicap系統(tǒng)測定血清IgE。所有兒童保持坐位，身體前傾，每側鼻孔用0.9%氯化鈉溶液沖洗鼻腔并搜集灌洗液[17]。將樣品離心以除去細胞碎片，并將等份的上清液在-20 ℃下分裝備用。根據(jù)Bradford使用Bio-Rad蛋白質(zhì)測定法測定總蛋白質(zhì)濃度。使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒來檢測血清和鼻腔灌洗液IL-33、IL-4、IL-5、IL-17和ECP水平（美國R&D公司）。檢測敏感度分別為：IL-33：125 pg/mL、IL-4：1.56 pg/mL、IL-5：7.8 pg/mL、IL-17：5 pg/mL。使用淋巴細胞分離液Ficoll制備外周血單個核細胞，然后以2×106/mL的密度在24孔板的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)（5%人AB血清、5 mmol/L谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素）。通過添加磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、粉塵螨蛋白（HDM，100 ng/mL）、重組人（rh）IL-33（1～100 ng/mL）、rhIL-33+rhIL-4（100 ng/mL）、rhIL-33+rhIL-5（100 ng/mL）、rhIL-33+rhIL-17（100 ng/mL）、HDM+anti-IL-33（100 ng/mL）進行刺激實驗48 h，試劑均由美國R&D公司提供。所有實驗重復三次。

1.3 觀察指標 比較三組血清和鼻腔灌洗液中IL-33和Th2/17細胞因子的表達情況，分析變應性鼻炎患兒IL-33和Th相關細胞因子的相關性。純化外周血單個核細胞進行IL-33的體外調(diào)節(jié)實驗，分析重組IL-33和相關細胞因子對外周血單個核細胞Th2/17炎癥反應的調(diào)控作用。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;不符合正態(tài)分布的計量資料用M（P25，P75）表示，比較采用Mann-Whitney U檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。采用Pearson相關分析用于分析生物標志物表達之間的相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料與實驗室指標比較 三組性別與年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。變應性鼻炎組嗜酸性粒細胞計數(shù)、ECP及粉塵螨特異性IgE均高于對照組，而均低于變應性鼻炎伴哮喘組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。變應性鼻炎伴哮喘組中心粒細胞高于變應性鼻炎組與對照組（P<0.05）。變應性鼻炎組與變應性鼻炎伴哮喘組嗜堿性粒細胞計數(shù)均高于對照組（P<0.05）。三組單核細胞計數(shù)與淋巴細胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 三組血清和鼻腔灌洗液中IL-33與Th2、Th17細胞因子表達情況 變應性鼻炎組與變應性鼻炎伴哮喘組血清和鼻腔灌洗液IL-33、IL-4、IL-5、IL-17均高于對照組，且變應性鼻炎伴哮喘組均高于變應性鼻炎組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 變應性鼻炎患兒IL-33和Th相關細胞因子的相關性 血清和鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5、IL-17均與IL-33表達呈正相關（P<0.05）。血清ECP、粉塵螨特異性IgE水平及嗜酸性粒細胞計數(shù)均與血清IL-33表達呈正相關（P<0.05）。見表3。

2.4 外周血單個核細胞刺激實驗結果 HDM和1、10、100 ng/mL rhIL-33的IL-4、IL-5及IL-17水平均高于PBS，且10、100 ng/mL rhIL-33均高于1 ng/mL rhIL-33（P<0.05）。100 ng/mL rhIL-33的IL-4、IL-5及IL-17水平均高于HDM（P<0.05）。HDM+anti-IL-33的IL-4、IL-5及IL-17水平均高于PBS，而低于HDM（P<0.05）。rhIL-33+rhIL-4、rhIL-33+rhIL-5、rhIL-33+rhIL-17與100 ng/mL rhIL-33的IL-4、IL-5及IL-17水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1和表4。

3 討論

變態(tài)反應是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的疾病。鑒于其免疫學機制的復雜性，對源頭發(fā)病機制的認識將有助于獲得新的治療靶點，并可望取得更持久、更徹底的療效。目前研究表明變應性鼻炎的中IL-33表達升高與Th2、Th17炎癥的發(fā)展密切相關，為變應性鼻炎的發(fā)病機制提供了新思路。

IL-33是細胞因子IL-1家族的成員，如IL-1β和IL-18。IL-33被認為與Th2介導的變應性疾病相關，如哮喘、特應性皮炎以及宿主防御寄生蟲[18]。在哮喘的實驗模型中，阻斷IL-33/ST2信號級聯(lián)可降低疾病的嚴重程度[19-23]?？笽L-33抗體顯著降低體內(nèi)2型細胞因子產(chǎn)生、嗜酸性粒細胞炎癥和氣道高反應性[24]。本研究結果顯示，變應性鼻炎全身和局部IL-33細胞和Th2細胞因子的表達都顯著增加，而進一步相關性分析提示，血清和鼻腔灌洗液中IL-33表達與2型細胞因子相關，提示IL-33可促進全身和局部Th2炎癥。

研究顯示在小鼠哮喘模型中，Th17細胞不僅增強中性粒細胞氣道炎癥，而且同樣促進Th2細胞介導的嗜酸性粒細胞氣道炎癥[25]。IL-17是由Th17細胞產(chǎn)生的關鍵細胞因子。變應性鼻炎患者血清IL-17水平升高，并與臨床癥狀，外周嗜酸性粒細胞計數(shù)和用藥需要有關[8-9]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)升高的IL-17表達與IL-33表達相關，提示IL-33可能參與Th17炎癥。

為了確定IL-33在變應性鼻炎中的直接作用，本研究提純了變應性鼻炎和對照組供體的外周血單個核細胞。粉塵螨作為常見過敏原可引發(fā)Th2炎癥反應，因此被選為陽性對照。本研究結果顯示，用HDM和1、10、100 ng/mL rhIL-33刺激后，來自變應性鼻炎的外周血單個核細胞中的Th2細胞因子（IL-4、IL-5）和IL-17水平顯著上調(diào)，且呈劑量依賴模式。這些細胞因子可能來源于Th2、Th17細胞或者ILC細胞等，但其確切情況有待于后續(xù)研究。為了研究Th2細胞因子對IL-33表達的影響，進一步使用rhIL-4、rhIL-5、rhIL-17刺激外周血單個核細胞，結果顯示rhIL-33和rhIL-4、rhIL-5、rhIL-17分別聯(lián)合刺激外周血單個核細胞時，Th2、Th17細胞因子產(chǎn)生與IL-33單獨刺激無明顯變化，說明IL-4、IL-5和IL-17對IL-33的調(diào)控并無干預作用。然而，阻斷IL-33可減少粉塵螨誘導的Th2、Th17細胞因子產(chǎn)生，表明IL-33在Th2、Th17炎癥中起重要作用。這些結果表明IL-33參與變應性鼻炎的Th2、Th17炎癥反應是單向調(diào)控的。

綜上所述，IL-33是介導Th2、Th17炎癥的關鍵細胞因子，并且是預測變應性鼻炎嚴重程度的潛在標志物，本研究可能為今后變應性鼻炎的預防和治療提供新的目標。

參考文獻

[1] Li H，Chen S，Cheng L，et al.Chinese guideline on sublingual immunotherapy for allergic rhinitis and asthma[J].J Thorac Dis，2019，11（12）：4936-4950.

[2] Liu W，Cai J，F(xiàn)u Q，et al.Associations of ambient air pollutants with airway and allergic symptoms in 13，335 preschoolers in Shanghai，China[J].Chemosphere，2020，252：126600.

[3] Eifan A O，Durham S R.Pathogenesis of rhinitis[J].Clin Exp Allergy，2016，46（9）：1139-1151.

[4] Voskamp A L，Kormelink T G，van Wijk R G，et al.Modulating local airway immune responses to treat allergic asthma：lessons from experimental models and human studies[J].Semin Immunopathol，2020，42（1）：95-110.

[5] Paller A S，Spergel J M，Mina-Osorio P，et al.The atopic march and atopic multimorbidity：Many trajectories，many pathways[J].J Allergy Clin Immunol，2018，143（1）：46-55.

[6] Wakashin H，Hirose K，Maezawa Y，et al.IL-23 and Th17 cells enhance Th2-cell-mediated eosinophilic airway inflammation in mice[J].Am J Respir Crit Care Med，2008，178（10）：1023-1032.

[7] Wilson R H，Whitehead G S，Nakano H，et al.Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness[J].Am J Respir Crit Care Med，2009，180（8）：720-730.

[8] Liu Y，Zeng M，Liu Z.Th17 response and its regulation in inflammatory upper airway diseases[J].Clin Exp Allergy，2015，45（3）：602-612.

[9] Liu W，Zeng Q，Zhou L，et al.Leptin/osteopontin axis contributes to enhanced T helper 17 type responses in allergic rhinitis[J].Pediatr Allergy Immunol，2018，29（6）：622-629.

[10] Ding W，Zou G L，Zhang W，et al.Interleukin-33：Its Emerging Role in Allergic Diseases[J].Molecules，2018，23（7）：1665.

[11] Bergougnan C，Dittlein D C，Hümmer E，et al.Physical and immunological barrier of human primary nasal epithelial cells from non-allergic and allergic donors[J].World Allergy Organ J，2020，13（3）：100109.

[12] Glück J，Rymarczyk B，Jura-Szo?tys E，et al.Serum levels of interleukin 33 and its receptor ST2 in patients treated with subcutaneous allergen immunotherapy in intermittent allergic rhinitis[J].Cent Eur J Immunol，2019，44（2）：214-217.

[13] Smejda K，Borkowska A，Jerzynska J，et al.IL-33 is associated with allergy in children sensitized to the cat[J].Allergol Immunopathol（Madr），2020，48（2）：130-136.

[14] Akasaki S，Matsushita K，Kato Y，et al.Murine allergic rhinitis and nasal Th2 activation are mediated via TSLP-and IL-33-signaling pathways[J].Int Immunol，2016，28（2）：65-76.

[15] Bro?ek J L，Bousquet J，Agache I，et al.Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma（ARIA）guidelines-2016 revision[J].J Allergy Clin Immunol，2017，140（4）：950-958.

[16] Pedersen S E，Hurd S S，Lemanske R F，et al.Global strategy for the diagnosis and management of asthma in children 5 years and younger[J].Pediatr Pulmonol，2011，46（1）：1-17.

[17] Kristina I，J?rgen P P，Magnus P B，et al.Clara cell protein in nasal lavage fluid and nasal nitric oxide-biomarkers with anti-inflammatory properties in allergic rhinitis[J].Clin Mol Allergy，2012，10：4.

[18] Donovan C，Hansbro P M.IL-33 in Chronic Respiratory Disease：From Preclinical to Clinical Studies[J].ACS Pharmacol Transl Sci，2019，3（1）：56-62.

[19] Khaitov M R，Gaisina A R，Shilovskiy I P，et al.The Role of Interleukin-33 in Pathogenesis of Bronchial Asthma.New Experimental Data[J].Biochemistry（Mosc），2018，83（1）：13-25.

[20] Du X，Li C，Wang W，et al.IL-33 induced airways inflammation is partially dependent on IL-9[J].Cell Immunol，2020，352：104098.

[21] Cai H，Wang J，Mo Y，et al.Salidroside suppresses group 2 innate lymphoid cell-mediated allergic airway inflammation by targeting IL-33/ST2 axis[J].Int Immuno，2020，81：106243.

[22] Cayrol C，Girard J P.IL-33：an alarmin cytokine with crucial roles in innate immunity，inflammation and allergy[J].Curr Opin Immunol，2014，31：31-37.

[23] Pushparaj P N，Tay H K，Hng S C，et al.The cytokine interleukin-33 mediates anaphylactic shock[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（24）：9773-9778.

[24] Allinne J，Scott G，Lim W K，et al.IL-33 blockade affects mediators of persistence and exacerbation in a model of chronic airway inflammation[J].J Allergy Clin Immunol，2019，144（6）：1624-1637.

[25] Park S C，Kim H，Bak Y，et al.An Alternative Dendritic Cell-Induced Murine Model of Asthma Exhibiting a Robust Th2/Th17-Skewed Response[J].Allergy Asthma Immunol Res，2020，12（3）：537-555.

（收稿日期：2020-06-03） （本文編輯：田婧）